DNR SEKOS NUSTATYMAS: MAXAM-GILBERT, METODAS IR PAVYZDŽIAI - BIOLOGIJA - 2025

DNR sekos (Deoksiribonukleorūgštis) yra molekulinės biologijos laboratorijos procedūra, kuri leidžia , kad žinoti, nukleotidų tvarką genetinės medžiagos interesų. Be to, galima atskleisti RNR (ribonukleino rūgšties) seką.

Ši technika buvo būtina biologinių mokslų plėtrai. Tai taip pat taikoma kitoms žinių sritims, tokioms kaip, pavyzdžiui, medicininė diagnozė ir kriminalistiniai tyrimai.

Šaltinis: pixabay.com

Anksčiau DNR grandinės sekos nustatymas buvo laikomas lėtu ir brangiu veiksmu, kuris leido identifikuoti tik keletą bazinių porų oligonukleotiduose.

Šiandien, atsižvelgiant į mokslo pažangą, DNR sekos nustatymas yra įprasta operacija daugelyje pasaulio laboratorijų, nes įnešta beveik 50 metų tyrimų šioje srityje. Pagal grandinės ilgį galima surinkti iki milijonų bazinių porų per labai trumpą laiką.

Tam yra sukurta dešimtys metodų, kurių kaina ir tikslumas skiriasi. Šiame straipsnyje mes aprašysime tiek klasikinę, tiek šiuolaikinę techniką, kiekvienas su savo privalumais ir trūkumais.

Iki šiol sekos sudarymo būdai leidžia gauti ištisų genomų seką, pradedant nuo mažų prokariotų ir mielių iki žmogaus genomo.

DNR struktūra

Norint suprasti DNR sekos nustatymo metodus ir būdus, būtina žinoti tam tikrus pagrindinius molekulės struktūros ir sudėties aspektus.

DNR yra biomolekulė, randama visuose gyvuose daiktuose, pradedant bakterijomis ir baigiant dideliais vandens gyvūnais. Organeliai - kaip mitochondrijos ir chloroplastai - turi apvalią DNR molekulę. Net kai kuriuose virusuose rasta genetinė medžiaga yra DNR.

Iš esmės DNR yra nukleotidų kolekcija. Kiekvienas iš jų yra sudarytas iš angliavandenių, azoto bazės (A, T, C arba G) ir fosfato grupės. DNR sekos nustatymo tikslas yra atskleisti, kokia tvarka keturios azoto bazės randamos sekoje.

Istorija

Dešimtojo dešimtmečio viduryje tyrėjai Watsonas ir Crickas aprašė DNR struktūrą, naudodamiesi kristologiniais metodais. Tačiau nė vienam iš šių tyrinėtojų nepavyko rasti būdo išardyti seką.

Nors buvo keletas pirmtakų, svarbiausias įvykis buvo Sangerio metodo sukūrimas 1977 m. Frederikas Sangeris, metodo tėvas, buvo britų biochemikas, laimėjęs dvi Nobelio premijas už didžiulį indėlį į biologinius mokslus.

Ši technika literatūroje taip pat žinoma kaip „grandinės pasibaigimas“ arba dideoksinukleotidai. Toliau bus aprašyti šios technologijos principai ir principai, kurie buvo sukurti remiantis jos tobulinimu ir naujovėmis.

Sangerio metodas

Sangerio metodo plėtra buvo lemiamas įvykis molekulinėje biologijoje. Tai apima pagrindinius DNR replikacijos proceso komponentus, kurie paprastai vyksta ląstelėje, tačiau pridedami specialūs komponentai: dideoksinukleotidai.

Pagrindiniai reakcijos komponentai

- DNR polimerazė: DNR polimerazės fermentas yra esminis proceso elementas. Ši molekulė dalyvauja DNR grandinės replikacijoje ir jos vaidmuo yra naujos grandinės sintezė, suporuojant trifosfato dezoksiribonukleotidus su papildomais.

Prisiminkite, kad DNR timinai (T) poruojasi su adeninais (A) per du vandenilio ryšius, o citozinas (C) tai daro su guaninu (G) per tris ryšius.

- Nukleotidai: Sangerio seka apima dviejų tipų nukleotidus: keturis 2'-deoksinukleotidus (sutrumpintai kaip dATP, dGTP, dCTP ir dTTP) ir keturis dideoksinukleotidus (ddATP, ddGTP, ddCTP ir ddTTP).

Nors dideoksinukleotidai yra panašūs į monomerus, kurie paprastai yra įterpiami į DNR, jų struktūroje nėra -OH grupės. Dėl to neįmanoma į grandinę pridėti naujo nukleotido.

Todėl, kai į susidariusią grandinę pridedamas specialus nukleotidas (visiškai atsitiktinis būdas), sintezė yra paralyžiuota. Taigi, reakcijos pabaigoje yra skirtingo dydžio grandinės, kiekviena iš jų, kur reakcija buvo sustabdyta skirtingu tašku.

Eksperimentiškai paruošiami keturi testai. Kiekviename jų yra DNR, išgautos iš dominančio biologinio mėginio, normalūs nukleotidai ir vienas iš keturių specialiųjų nukleotidų tipų. Specialieji nukleotidai yra pažymėti tam tikros rūšies fluorescenciniais žymekliais (žr. Žemiau pateiktą automatinį seką).

Rezultatų skaitymas

Pirmasis žingsnis yra atskirti kiekvieną susintetintą grandinę pagal jų dydį. Kai kurios bus ilgesnės nei kitos, atsižvelgiant į tai, kur buvo įmontuotos specialios bazės.

Yra įvairių biocheminių metodų, leidžiančių atskirti mišinio komponentus, naudojant dydį kaip diskriminuojančią savybę. Taikant Sangerio metodą, skirtingos grandinės yra atskirtos elektroforeze. Sudėtingesniuose technikos variantuose naudojama kapiliarinė elektroforezė.

Taigi ilgesnės sruogos juda mažiau nei trumpesnės. Tada ši sistema eina per skaitytuvą, atpažįstantį žymeklį, įeinantį į kiekvieną dideoksinukleotidą. Tokiu būdu galima sužinoti sekos tvarką.

Ši „pirmosios kartos“ technika gali nuskaityti ne didesnius kaip 1 kilobazės DNR fragmentus. Šiuo metu Sangerio metodas yra naudojamas įvairiose laboratorijose, paprastai jo moderniuose variantuose. Be to, jis naudojamas norint patvirtinti rezultatus, gautus naudojant pačius sudėtingiausius metodus, tačiau ne tokius tikslus.

Automatinis sekos nustatymas

Kai reikia atlikti sekos nustatymą dideliu mastu, procesas paspartėja automatizuojant. Tai yra „Sanger“ grandinės nutraukimo metodo variantas, kai pradmenys žymimi fluorescenciniais produktais, kad juos būtų galima atskirti.

Po to reakcijos produktas atliekamas elektroforezės būdu - visa viena juosta. Kadangi kiekvienas fragmentas išeina iš galutinės gelio dalies, jis greitai atpažįstamas pagal fluorescencinį ženklinimą, kurio paklaida yra 1%.

Sudėtingiausios sistemos turi iki 96 kapiliarinių vamzdžių sistemą, valdomą kompiuterio, sujungto su robotu. Tai yra, 96 DNR pavyzdžiai gali būti tiriami vienu metu. Taigi elektroforezės ir rezultatų analizės procesas yra visiškai automatizuotas.

Per vieną dieną šios sistemos gali sekti iki 550 000 bazių. Proceso metu žmogaus darbas nėra būtinas, o metodo paleidimas užtrunka tik apie 15 minučių.

Maksamo-Gilberto sekos nustatymas

Tuo pačiu metu, kai Sangeris paskelbė savo darbą, dviem tyrėjams, pavadintiems Allan Maxan ir Walter Gilbert, pavyko sukurti kitą metodą, kaip gauti DNR seką. Tuo metu šis metodas išpopuliarėjo, tačiau vėliau jį pakeitė patobulinęs Sangerio metodas.

Priešingai nei Sangerio metodas, Maxano ir Gilberto sekos nustatymas (arba cheminis sekvenavimas, kaip tai taip pat žinoma) nėra susijęs su hibridizacijos reakcijomis. Metodiką sudaro ženklinimas reagentais viename gale, o po to - gryninimo procesas.

Vienas iš neigiamų šios technikos aspektų yra didžiulis jos sudėtingumas ir vartotojui pavojingų cheminių medžiagų naudojimas. Chemines pertraukas skatina DMS, skruzdžių rūgštis, hidrazinas ir hidrazinas su druskomis.

Procesas

Protokolas prasideda ženklinimu 5 'stygos gale su fosforo žymekliu 32, tada vyksta cheminė azoto bazės modifikacija ir ji yra atskiriama. Galiausiai įvyksta abasinio regiono skilimas.

Pirmiausia sutrumpinate eilutę, kurią norite sekti į mažesnius segmentus. Šis žingsnis atliekamas su restrikcijos fermentais, dėl kurių galai išsikiša.

Po to reakcija vykdoma su šarmine fosfataze, kurios tikslas yra pašalinti fosfato grupę. Taigi ženklinimui gali būti naudojama polinukleotidinė kinazė.

Grandinė denatūruota (abi sruogos atsidaro). Tada chemikalai užpilami. Šios skilimo reakcijos vyksta kontroliuojamu būdu ir yra žinoma, kokio tipo jungtys suyra.

Rezultatų skaitymas

Kaip ir naudojant Sangerio metodą, rezultatų nuskaitymas apima grandinių, gautų elektroforezės sistemoje, atskyrimą pagal dydį. Sistemos, sudarytos iš poliakrilamido, leidžia gauti labai tinkamą skiriamąją gebą geliui nuskaityti.

Mišių sekos nustatymas

Masinis sekos sudarymas apima daugybę naujų metodų, sutrumpintai vadinamų NGS, iš anglų kalbos „Next Generation Sequencing“.

Metodams, klasifikuojamiems kaip NGS, reikalingas ankstesnis DNR amplifikacijos žingsnis (jie neveikia su viena molekule). Be to, naudojamos platformos labai skiriasi. Toliau bus aprašyti populiariausių metodų principai:

Pirosekvencija

Tai apima pirofosfato išsiskyrimo stebėjimą, kuris vyksta kiekvieną kartą, kai į DNR grandinę pridedamas naujas nukleotidas. Fermentų sistema yra sujungta taip, kad kiekvieną kartą, kai įterpiamas naujas nukleotidas, skleidžiama šviesa (kurią galima aptikti fotoaparatu).

Procesas prasideda atskiru kiekvienos azoto bazės inkubavimu, siekiant patikrinti, ar skleidžiama šviesa. Pirosekvencija gali skaityti ilgas gijas, tačiau rastas klaidų lygis yra didelis.

Sintezės seka

Tai apima paženklintų nukleotidų įtraukimą. Šie fluorescenciniai komponentai pridedami, plaunami ir pažymimas įterptas nukleotidas. Tada nukleotido etiketė pašalinama, o stygos sintezė gali būti tęsiama. Kitame etape taip pat bus įterptas paženklintas nukleotidas, ir aukščiau aprašyti veiksmai bus pakartoti.

Šios technologijos trūkumas yra tada, kai fluorescenciniai žymekliai nėra visiškai pašalinti. Dėl šių išmetamųjų teršalų susidaro foninės klaidos, todėl padaryta reikšmingų klaidų.

Ligacijos seka

Ši technika skiriasi nuo kitų, nes joje nenaudojama DNR polimerazė. Vietoj to, pagrindinis šios metodikos fermentas yra ligazė. Čia naudojami fluorescenciniu būdu pažymėti DNR fragmentai, jie yra susieti fermento pagalba ir yra aptinkami.

Didžiausia šios technologijos problema yra trumpas fragmento ilgis, kurį jis gali apdoroti.

Jonų torrentų sekos

Ši technika pagrįsta H ⁺ jonų , išsiskiriančių kiekvieną kartą, kai įterpiamas naujas nukleotidas, matavimais . Principas yra gana panašus į pirosequencing, bet daug pigesnis.

Pavyzdžiai

Žmogaus genomo sekos nustatymas

Žmogaus genomo sekvenavimas buvo vienas iš perspektyviausių iššūkių biologijoje, taip pat yra vienas iš labiausiai pripažintų prieštaravimų mokslo istorijoje. Tiesą sakant, projekte dalyvavusiems mokslininkams genomo sekvenavimas tapo konkurencija.

1990 m. Jis pradėjo vadinamąjį „žmogaus genomo projektą“, kuriam vadovavo garsus mokslininkas, Nobelio premijos laureatas Jamesas Watsonas. Po metų, 1991 m., Venteris priima iššūkį „sumušti“ Watsoną ir sukonkretinti prieš jį esantį genomą. Tačiau 1992 m. Watsonas pasitraukė ir komandą perėmė kitas tyrėjas.

1995 m. Venteris paskelbė savo sėkmę atliekant visišką bakterijų genomo sekvenavimą atsitiktinės sekos metodu. Panašiai priešinga komanda paskelbė po metų mielių genomo sekos nustatymo.

2000 m. Laipsnis buvo nutrauktas. Abi bendrovės paskelbė preliminarius viso genomo rezultatus dviejuose prestižiškiausiuose mokslo žurnaluose: „Gamta“ ir „Mokslas“.

Tačiau mokslininkai toliau tobulino pasiūlymus, o 2006 m. Buvo baigtos tam tikrų žmogaus chromosomų sekos.

Svarba ir programos

Žinant tiek svarbios molekulės, kiek DNR, nukleotidų tvarką, biologams ir susijusiems specialistams yra vertinga. Šioje polinukleotidų grandinėje yra visa informacija, reikalinga visų rūšių gyvūnams kurti ir palaikyti.

Dėl šių priežasčių žinios apie šią seką yra būtinos atliekant biologinius tyrimus. Iš esmės sekos sudarymas leidžia išmatuoti vieną iš svarbiausių biologinių sistemų savybių ir nustatyti skirtumus tarp jų.

Sekavimą plačiai naudoja taksonomistai ir sistematikai, nes tam tikros DNR sekos leidžia nustatyti kriterijus, leidžiančius padaryti išvadą, ar du organizmai priklauso tai pačiai rūšiai, be to, kad gali siūlyti hipozes apie filogenetinius ryšius tarp jų.

Be to, DNR seka gali būti naudojama medicinoje ir diagnostikoje. Pavyzdžiui, yra nebrangių ir prieinamų sistemų, kurios sekos darymo būdu leidžia įvertinti polinkį susirgti tam tikromis ligomis (pavyzdžiui, vėžiu), naudojant vadinamuosius vieno nukleotido polimorfizmus (SNP).

Kriminalinio ir teismo pobūdžio tyrimai taip pat buvo praturtinti sekos sudarymo metodais, kurie gali būti naudojami kaip patikimi įrodymai apie tam tikro asmens dalyvavimą nusikaltime.

Nuorodos

1. Heather, JM, & Chain, B. (2016). Sektorių seka: sekos DNR istorija. Genomika, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK, & Mardis, ER (2013). Naujos kartos sekavimo revoliucija ir jos poveikis genomikai. Cell, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Mokslo varžybos. Nuo „Galileo“ iki žmogaus genomo projekto. Redakcija Paraninfo.
4. Sangeris, F., Nicklenas, S., ir Coulsonas, AR (1977). DNR sekos nustatymas grandinę nutraukiančiais inhibitoriais. Nacionalinės mokslų akademijos leidiniai, 74 (12), 5463-5467.
5. Schusteris, SC (2007). Naujos kartos seka keičia šiandienos biologiją. Gamtos būdai, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (Red.). (2014). Naujos kartos sekos. Caister Academic Press.