„GIEMSA“ DĖMĖ: PAGRINDIMAS, MEDŽIAGOS, TECHNIKA IR NAUDOJIMO BŪDAI - BIOLOGIJA - 2025

„ Giemsa“ dėmė yra dažančių klinikinių mėginių rūšis, pagrįsta rūgščių ir bazinių dažų mišiniu. Jos sukūrimas buvo įkvėptas Romanowskio atlikto darbo, kai chemikas ir bakteriologas iš Vokietijos, Gustavas Giemsa, jį patobulino pridėdamas glicerolio, kad stabilizuotų junginius.

Originalios Romanowsky technikos pokyčiai leido žymiai pagerinti mikroskopinius stebėjimus, todėl ši technika buvo pakrikštyta Giemsa dėmės pavadinimu.

Įvairūs mėginiai dažyti „Giemsa“ dėme. A. Trypanosoma evansi periferiniame kraujyje. B. Normalios kraujo ląstelės. C. Borrelia theileri periferiniame kraujyje. D. Burkitto limfoma.

Kadangi tai atlikti yra labai paprasta, labai funkcionali ir ekonomiška metodika, ji šiuo metu plačiai naudojama hematologinių tepinėlių, kaulų čiulpų mėginių ir audinių skyrių klinikinėje laboratorijoje.

„Giemsa“ dažymo technika yra labai naudinga atliekant citologinius tyrimus, nes ji leidžia stebėti specifines ląstelių struktūras. Šis būdas nudažo ląstelių citoplazmas, branduolius, nukleolius, vakuolius ir granules, kad būtų galima atskirti net smulkius chromatino pėdsakus.

Be to, galima aptikti reikšmingų branduolio dydžio, formos ar spalvos pokyčių, kai įmanoma nustatyti branduolio ir citoplazmos santykio praradimą.

Kita vertus, tai leidžia nustatyti nesubrendusias kaulų čiulpų ir periferinio kraujo ląsteles, kurios yra svarbios diagnozuojant rimtas ligas, tokias kaip leukemija. Taip pat galima aptikti hemoparazitus, papildomas ir tarpląstelines bakterijas, grybelius.

Citogenetikoje jis plačiai naudojamas, nes galima ištirti ląstelių mitozę.

Giemsa dažymo pagrindas

Romanowsky tipo dažai yra naudojami naudojant rūgščių ir šarminių dažų kontrastą, kad būtų nudažytos atitinkamai bazinės ir rūgštinės struktūros. Kaip matyti, rūgštiniai dažai yra panašūs į pagrindines struktūras ir atvirkščiai.

Pagrindiniai naudojami dažai yra metileno mėlynasis ir jo oksiduoti dariniai (Azure A ir Azure B), o rūgštiniai dažai yra eozinas.

Rūgštinės ląstelių struktūros yra nukleorūgštys, segmentinių bazofilų granulės, be kita ko, todėl jos bus dažytos metileno mėlynuoju.

Ta pačia prasme pagrindinės ląstelių struktūros yra hemoglobinas ir kai kurios granulės, tokios kaip granulės, esančios segmentiniuose eozinofiluose, be kita ko; jie bus dažyti eozinu.

Kita vertus, dėl to, kad metileno mėlynajai ir azureatai būdingi metachromatiniai dažikliai, jie gali suteikti kintamą atspalvį skirtingoms struktūroms pagal jų turimų polianjonų apkrovą.

Taip strateginis bazinių ir rūgštinių dažų derinys sugeba sukurti platų spalvų spektrą, atsižvelgiant į kiekvienos struktūros biochemines savybes, esant rūgščioms struktūroms, einant per šviesiai mėlynos, tamsiai mėlynos, alyvinės ir violetinės spalvos atspalvius.

Nors eozino spalvos yra stabilesnės, jos sukuria spalvas tarp rausvai oranžinės ir lašišos.

medžiagos

Pradinio tirpalo paruošimo medžiagos

Norint paruošti pradinį tirpalą, reikia pasverti 600 mg miltelių pavidalo „Giemsa“ dėmės, išmatuoti 500 cc metilo alkoholio be acetono ir 50 cc neutralaus glicerino.

Kaip paruošti pradinį tirpalą

Įmaišykite sunkius „Giemsa“ miltelius į skiedinį. Jei yra gabalėlių, juos reikia purkšti. Po to įpilkite nemažą kiekį išmatuoto glicerino ir labai gerai išmaišykite. Gautas mišinys supilamas į labai švarų gintaro buteliuką.

Likęs glicerino kiekis dedamas į skiedinį. Dar kartą sumaišykite, kad nuvalytumėte likusį dažiklio kiekį, prilipusį prie skiedinio sienų, ir supilkite į tą patį indelį.

Butelis uždaromas ir 2 valandoms dedamas į 55ºC vandens vonią. Kol jis yra vandens vonioje, atsargiai kas pusvalandį purtykite mišinį.

Vėliau mišiniui leidžiama atvėsti, kad įdėtų alkoholio. Anksčiau dalis išmatuoto alkoholio įpilama į skiedinį, kad būtų galima nusiplauti likusį dažiklį, tada įpilama į mišinį kartu su likusiu alkoholiu.

Šį preparatą reikia palikti brandinti mažiausiai 2 savaites. Panaudota pradinio tirpalo dalis turėtų būti filtruojama.

Norint išvengti preparato užteršimo, rekomenduojama nuolat vartoti tą porciją, kurią perkelsite į mažą gintaro buteliuką su lašintuvu. Kiekvieną kartą užpildykite reagentą.

Buferinio tirpalo paruošimo medžiagos

Kita vertus, buferinis tirpalas, kurio pH 7,2, paruošiamas taip:

6,77 g bevandenio natrio fosfato (NaHPO ₄ ), 2,59 g kalio dihidro fosfato (KH ₂ PO ₄ ) ir distiliuoto vandens pasveriami iki 1000 cc.

Galutinis dažiklio paruošimas

Norint paruošti galutinį dažymo tirpalą, išmatuojama 2 ml filtruoto pradinio tirpalo ir sumaišoma su 6 ml buferinio tirpalo. Išmaišykite mišinį.

Svarbus faktas, į kurį reikia atsižvelgti, yra tas, kad dažymo paruošimo būdai gali keistis priklausomai nuo komercinės įmonės.

Papildomos medžiagos, reikalingos dažymui

Be aprašytų medžiagų, turite turėti dažymo tiltelius, marškinėlius su vandeniu ar buferiu, skirtu skalbti, objektų skaidres ar dangčius daiktams, chronometrą, skirtą dažymo laikams kontroliuoti, blizginį popierių ar kitą medžiagą, kurią galima panaudoti džiovinimui ( marlė ar medvilnė).

Technika

Dažymo procesas

1) Prieš dažydami, mėginio tepinėlis turi būti paruoštas ant švarios skaidrės.

Mėginiai gali būti kraujo, kaulų čiulpų, histologinio audinio pjūviai arba gimdos kaklelio ir makšties mėginiai. Prieš dažymą rekomenduojama, kad užtepai būtų ploni ir 1 arba 2 valandas nudžiūtų.

2) Ant dažymo tiltelio uždėkite visus spalvotus lapus. Jūs visada dirbate ta pačia tvarka ir kiekvienas lapas yra gerai atpažįstamas.

3) Į tepinėlį įlašinkite kelis lašus 100% metilo alkoholio (metanolio) ir leiskite jam veikti 3–5 minutes, kad mėginys būtų fiksuotas ir dehidratuotas.

4) Išmeskite lape esantį metanolį ir leiskite išdžiūti.

5) Išdžiūvę, įpilkite galutinio dažymo tirpalo lašintuvu, kol visas lapas bus padengtas. Palikite veikti 15 minučių. Kai kurie autoriai rekomenduoja iki 25 min. Tai priklauso nuo verslo namo.

6) Nusausinkite dėmę ir nuplaukite tepinėlį distiliuotu vandeniu arba 7,2 buferiniu tirpalu.

7) Ant blizgaus popieriaus palikite lapus išdžiūti lauke, vertikaliai išdėstytais atramos pagalba.

8) Nuvalykite stiklinės užpakalinę dalį alkoholio ar medvilnės tamponu, kad pašalintumėte dėmės pėdsakus.

Komunalinės paslaugos

„Giemsa“ dažymo technika naudojama įvairiose srityse, įskaitant hematologiją, mikologiją, bakteriologiją, parazitologiją, citologiją ir citogenetiką.

Hematologija

Tai dažniausiai naudojama ši dėmė. Su ja galima atpažinti kiekvieną ląstelę, esančią kaulų čiulpų ar periferinio kraujo mėginiuose. Taip pat įvertinti kiekvienos serijos skaičių, sugebėti nustatyti leukocitozę ar leukopeniją, trombocitopeniją ir kt.

Kadangi jis yra jautrus nesubrendusių ląstelių identifikavimui, jis yra svarbus diagnozuojant ūminę ar lėtinę leukemiją. Taip pat galima diagnozuoti anemiją, pvz., Pjautuvo pavidalo ląstelių anemiją, pjautuvo pavidalo ląstelę.

Mikologija

Šioje srityje jo naudojimas yra įprastas Histoplasma capsulatum (tarpląstelinio dimorfinio grybelio) paieškai audinių mėginiuose.

Bakteriologija

Hematologiniuose tepinėliuose, dažytuose „Giemsa“, galima aptikti Borrelias sp pacientams, sergantiems liga, vadinama pasikartojančia karščiavimu. Mėginiuose, paimtuose karščiavimo metu, eritrocituose gausu spirocitų.

Taip pat užkrėstose ląstelėse galima vizualizuoti tarpląstelines bakterijas, tokias kaip Rickettsia sp ir Chlamydia trachomatis.

parazitologija

Parazitologijos srityje „Giemsa“ dažymas leido diagnozuoti tokias parazitines ligas kaip maliarija, Chagos liga ir leišmaniozė.

Pirmuosiuose dviejuose infekuotų pacientų periferiniame kraujyje galima pastebėti atitinkamai Plasmodium sp ir Trypanosoma cruzi parazitus, jie gali būti randami skirtingais etapais, priklausomai nuo ligos stadijos.

Norint pagerinti parazitų paiešką kraujyje, rekomenduojama naudoti Giemsa dėmę, sumaišytą su May-Grünwald dėme.

Odos leišmaniozę taip pat galima diagnozuoti įvertinus Giemsa dažytos odos biopsijos mėginius ten, kur randamas parazitas.

Citologija

Giemsa dažymas taip pat naudojamas citologiniam endocervikalinių mėginių tyrimui, nors tai nėra dažniausiai naudojama technika šiam tikslui.

Tačiau tais atvejais, kai trūksta išteklių, jis gali būti naudojamas, turintis panašų funkcionalumą, kokį siūlo „Papanicolaou“ technika, ir mažesnėmis sąnaudomis. Tačiau tam reikalinga eksperto kompetencija.

Citogenetika

Svarbi „Giemsa“ dažymo ypatybė yra jo gebėjimas stipriai jungtis prie adenino ir timino turinčių DNR sričių. Tai leidžia vizualizuoti DNR ląstelių mitozės metu, esant skirtingoms kondensacijos būsenoms.

Šie tyrimai yra būtini norint nustatyti chromatines aberacijas, tokias kaip skirtingų chromosomų sričių dubliavimosi, trynimas ar perkėlimas.

Tyrimai, įrodantys „Giemsa“ dėmės efektyvumą

Cannova ir kt. (2016) palygino 3 dažymo būdus odos leišmaniozės diagnozei.

Tam jie naudojo mėginius, gautus iš eksperimento gyvūno (Mesocrisetus auratus), eksperimentiškai pasodinto Leishmanias.

Autoriai parodė, kad „Giemsa“ dėmė buvo geresnė nei „Pap-mart®“ ir „Gaffney“ dėmių. Todėl jie laikė, kad Giemsa dėmė yra ideali diagnozuojant odos leishmaniozę.

Puikius autorių pasiektus rezultatus lemia tai, kad dažų derinys, iš kurio sudarytas „Giemsa“ mišinys, sukuria būtinas sąlygas sukurti teigiamą kontrastą, leidžiant aiškiai atskirti amastigotų struktūras tiek vidinėje, tiek tarpląstelinėje plotmėje.

Kiti metodai („Pap-mart®“ ir „Gaffney“) taip pat tai padarė, tačiau silpnesniu būdu, todėl sunkiau vizualizuoti. Štai kodėl parazitologinei leišmaniozės diagnozei nustatyti rekomenduojama Giemsa dėmė.

Panašiai, Ramírez ir kt. (1994) atliktas tyrimas įvertino Giemsa ir Lendrum dėmių junginės tepinėlių pagrįstumą Chlamydia trachomatis identifikavimui.

Autoriai nustatė, kad „Giemsa“ ir „Ledrum“ dėmės turi vienodą specifiškumą, tačiau buvo nustatyta, kad „Giemsa“ yra jautresnės.

Tai paaiškina, kodėl „Giemsa“ dėmė dažniausiai naudojama diagnozuojant chlamidines infekcijas, ypač jei išteklių yra nedaug.

Šaltinis: „PanReac Applyhem ITW“ reagentai. Giemsa dėmė. 2 versija: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Ispanija.

Gero dažymo rekomendacijos

Lakštų džiūvimas neturėtų būti spartinamas. Tikimasi, kad reikia pakankamai laiko išdžiovinti lauke. Maždaug 2 valandos.

Norėdami gauti geriausius rezultatus, dažykite iškart po 2 valandų.

Kad tepinėliai geriau įsitvirtintų ir nesusidarytų, mėginys turi būti paskirstytas ant stiklelio taip, kad liktų plonas ir vienodas sluoksnis.

Geriausias kraujo mėginys yra kapiliarinis, nes tepinėlis gaminamas tiesiai iš kraujo lašo, todėl mėginyje nėra jokių priedų, kurie palaiko ląstelių struktūrų palaikymą.

Tačiau jei naudojamas veninis kraujas, EDTA turėtų būti naudojamas kaip antikoaguliantas, o ne heparinas, nes heparinas paprastai deformuoja ląsteles.

Dažnos Giemsa dažymo klaidos

Šio dažymo praktikoje gali būti padaryta klaidų. Juos liudija staigūs struktūrų tonalumo pokyčiai.

Ypatingai mėlyna spalva

Tai gali būti dėl:

• Labai stori tepinėliai
• Didesnis dažymo laikas
• Nuplaukite nepakankamai.
• Reagentų, žymiai aukštesnių nei neutralus (šarminis) pH, naudojimas.

Esant tokioms sąlygoms, šių struktūrų spalvos yra iškraipomos taip, kad užuot lašišai rožinės spalvos, eritrocitai pasirodys žali, eozinofilų granulės, kurios turi būti dažytos plytų raudonai, taps melsvos arba pilkos spalvos ir tt nuokrypis įprastais tonais.

Pernelyg rausvos spalvos

Tai gali būti dėl:

• Nepakankamas dažymo laikas.
• Ilgai trunkantis ar per didelis skalbimas.
• Blogas džiūvimas.
• Labai rūgščių reagentų naudojimas.

Šiuo konkrečiu atveju struktūros, kurios paprastai nusidažo mėlyna spalva, beveik nebus matomos, o rožinės spalvos struktūros turės labai perdėtus atspalvius.

Pavyzdys: Eritrocitai taps ryškiai raudoni arba ryškiai oranžiniai, branduolinis chromatinas pasirodys šviesiai rausvas, o eozinofilų granulės nusidažys ryškiai raudonai.

Kritiniuose yra nuosėdų

Priežastys gali būti:

• Naudokite nešvarias ar prastai nuplautas plėveles.
• Neleiskite tepiniui gerai išdžiūti.
• Palikite tvirtinimo tirpalą per ilgai.
• Netinkamas plovimas dažymo pabaigoje.
• Netinkamas naudojamo dažiklio filtravimas arba jo nefiltruojama.

Morfologinių artefaktų buvimas

Tepinėliuose gali atsirasti morfologinių artefaktų, todėl sunku vizualizuoti ir interpretuoti esamas struktūras. Tai yra dėl to:

• Naudojamų antikoaguliantų rūšis, pavyzdžiui, heparinas.
• Nešvarių, nusidėvėjusių ar riebių plėvelių naudojimas.

Saugojimo režimas

Po paruošimo dažai turi būti laikomi kambario temperatūroje (15–25 ° C), kad dažai nesikauptų. Jis turėtų būti laikomas sandariai uždarytame gintaro inde.

Nuorodos

1. Cannova D, Brito E ir Simons M. Odos leišmaniozės diagnozavimo dažymo metodų įvertinimas. Salus. 2016; 20 (2): 24–29.
2. „PanReac Applyhem ITW“ reagentai. Giemsa dėmė. 2 versija: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Ispanija.
3. Clarko G. Dažymo procedūros (1981), 4 t. Williamsas ir Willkinsas.
4. Taikomoji klinikinė chemija. „Giemsa“ dėmė in vitro diagnostikai. Platintojas: cromakit.es
5. „Ramírez I“, „Mejía M“, „García de la Riva J“, „Hermes F“ ir „Grazioso C.“ „Giemsa“ ir „Lendrum“ dėmių tinkamumas junginės tepinėliams Chlamydia trachomatis identifikavimui. Bol of Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212–216.
6. Casas-Rincón G. Bendroji mikologija. 1994 m. 2-asis Venesuelos centrinio universiteto leidimas. Venesuelos Karakasas.
7. "Giemsa dėmė". Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2017 Rugsėjo 1, 01:02 UTC. 2018 m. Gruodžio 6 d., Es.wikipedia.org.