„LÖWENSTEIN-JENSEN“ TERPĖ: PAGRINDAS, PARUOŠIMAS IR NAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Löwenstein-Jensen terpė yra selektyvus kieta terpė už izoliacijos ir vystymosi bakterijų genties Mycobacterium, pavyzdžiui, Mycobacterium tuberculosis, M. avium, be kita ko, su iš leprae rūšių, išskyrus, kuri nėra culturable.

Mycobacterium genties bakterijos neauga įprastose kultūrinėse terpėse, todėl joms išskirti reikėjo sukurti specialią terpę. Originalią terpę sukūrė Löwenstein, vėliau ją modifikavo Jensen.

Löwenstein-Jensen terpė su Mycobacterium tuberculosis kolonijomis. Šaltinis: Agarwal ir kt., „BioMed Central Ltd.“, sutikus su Biologijos vaizdų biblioteka

Pakeitimą sudarė Kongo raudonųjų dažų pašalinimas, pakeičiant juos didesne malachito žalia koncentracija. Tai taip pat pakeitė magnio citrato ir monokalio fosfato koncentracijas.

Šiuo metu Löwenstein-Jensen terpėje yra bulvių krakmolo, asparagino, magnio citrato, monokalio fosfato, magnio sulfato, malachito žaliosios, nalidikso rūgšties, cikloheksimido, linkomicino, sumuštų kiaušinių, glicerino ir vandens.

Paprastai mikobakterijos yra išskiriamos iš nesterilių vietų, tokių kaip skrepliai, šlapimas, abscesai. Tai reiškia, kad daugumoje mėginių bus įprasta to rajono mikrobiota ir patogenas.

Štai kodėl Löwenstein-Jensen terpėje yra daugybė inhibitorių, sudarytų iš malachito žaliųjų, antibiotikų ir priešgrybelinių.

Be to, mėginiai, paimti iš nesterilių vietų, prieš sėjant į Löwenstein-Jensen terpę, turi būti nukenksminti ir neutralizuoti.

Pagrindas

Kiaušinių ir glicerino buvimas Löwenstein-Jensen terpėje skatina mikobakterijų augimą, nes jos suteikia riebalų rūgščių ir baltymų, reikalingų šiems mikroorganizmams vystytis.

Löwenstein-Jensen terpėje yra žalios spalvos malachito, kuris yra lydinčios mikrobiotos inhibitorius. Tačiau jame taip pat yra nalidikso rūgšties (35 µg / ml), kuri slopina gramneigiamą mikrobiotą, cikloheksimido (400 µg / ml), kuris slopina saprofitinius grybus ir mieles, ir linkomicino (2 µ / ml), kuris slopina gramneigiamą mikrobiotą.

Kai kurie komerciniai namai nori pridėti šį antibiotikų derinį: polimiksinas B 200 000 vienetų / L, amfotericinas B 10 mg / L, karbenicilinas 50 mg / L ir trimetoprimas 10 mg / L.

Šioje terpėje nėra agaro, todėl terpė sukietėja dėl kiaušidėse esančio albumino krešėjimo sterilizacijos metu.

Paruošimas

Pasverkite 37,3 g dehidratuotos terpės 600 ml distiliuoto vandens, į kurį anksčiau buvo įpilta 12 ml glicerolio. Mišinys kaitinamas, maišant, kol jis visiškai ištirps. Autoklavizuokite terpę 15 minučių 121 ° C temperatūroje.

Kita vertus, aseptikos sąlygomis turėtų būti paruošta homogeninė 1000 ml šviežių kiaušinių suspensija. Į 600 ml terpės, paruoštos 50–60 ° C temperatūroje, įpilkite kiaušinių suspensijos, išvengdami oro burbuliukų.

Antibiotikų tirpalai taip pat pridedami po sterilizavimo autoklave.

Supilkite terpę į sterilius, užsukamus mėgintuvėlius. Mėgintuvėlius 45 minutes kaitinkite 85 ° C temperatūroje.

Paruošta terpė yra akvamarino žalia ir dėl kiaušinių lipidų gali būti balkšvos dėmės.

Terpės pH turi būti 7,2 ± 0,2

Vamzdelius laikykite šaldytuve ir iki naudojimo apsaugokite nuo tiesioginės šviesos. Temperatūra prieš sėją.

Yra laikmenos modifikacija, vadinama „Löwenstein Jensen Gruft modifikacija“. Jame yra tų pačių junginių, kaip ir klasikinėje terpėje, tačiau pridedama RNR-5 mg / 100 ml, o kaip inhibitoriai yra malachito žaliosios 0,025 g / 100 ml, penicilino 50 V / ml ir nalidikso rūgšties - 35 ug / ml.

Programos

Löwenstein-Jensen terpė naudojama mikobakterijų išskyrimui iš įvairių rūšių mėginių. Kiekvienam bandiniui, kuriame įtariama mikobakterijų buvimas, rekomenduojama naudoti Ziehl-Neelsen dėmę.

Kai kurie mėginiai yra iš sterilių vietų, kiti ne. Nesterilūs mėginiai turi būti atitinkamai nukenksminti:

Skrepliai

Skreplių mėginiai turėtų būti nukenksminti taip: nustatomas skreplių mėginio kiekis mililitrais ir įpilamas toks pat kiekis 4% NaOH į mėginį ir inkubuojamas 37 ° C temperatūroje.

Mišinį dažnai suplakite per 30 minučių. Vėliau centrifuguokite 3000 min / min 30 minučių.

Supernatantas išmetamas ant fenolio dezinfekavimo tirpalo. Sėjai naudokite nuosėdas, tačiau pirmiausia reikia neutralizuoti pH.

Nuosėdoms neutralizuoti naudojamas fenolio raudonojo indikatoriaus pavidalo 5% H ₂ SO _4, kol jis pasiekia neutralų pH, kuris sukelia lašišos spalvą.

Skrandžio plovimas, bronchų plovimas ir bronchų aspiracija

Tokiu atveju mėginys 30 minučių turi būti centrifuguojamas esant 3000 aps./min. Supernatantas išmetamas ir naudojamas nuosėdos. Norėdami nukenksminti nuosėdas, įpilkite 3 ml 4% NaOH ir pusvalandį dažnai maišykite 37 ° C temperatūroje.

Dar kartą centrifuguokite, supernatantas išmetamas ir naudojamas nuosėdos. Pastarosios turi būti neutralizuotos, kaip paaiškinta skreplių mėginyje.

Šlapimas

Leiskite mėginiui 24 valandas nusistovėti šaldytuve. Atskirkite supernatantą. Likęs nuosėdos turėtų būti centrifuguojamos 30 minučių esant 3000 RPK. Vėl išmeskite supernatantą ir ištirpinkite nuosėdas 3 ml sterilaus fiziologinio tirpalo.

Įpilkite 3 ml 4% NaOH ir nukenksminkite ir neutralizuokite, kaip aprašyta anksčiau.

Ascito skystis, pleuros skystis, smegenų skystis

Šio tipo mėginiuose jis centrifuguojamas, o supernatantas išmetamas. Atlikite gramą ant nuosėdų arba stebėkite tiesiai po mikroskopu; Jei bakterijų nepastebėta, nukenksminimo žingsnis nėra būtinas, taip pat nereikia neutralizuoti.

Tokiu atveju mėginį galima pasėti tiesiogiai naudojant nuosėdas. Jei yra bakterijų, nukenksminkite ir neutralizuokite, kaip aprašyta aukščiau.

Biopsijos

Į šio tipo mėginį reikia įpilti 5 ml distiliuoto vandens, kad vėliau būtų centrifuguota 10 minučių esant 1500 aps / min. Supernatantas išpilamas ir nuosėdos 30 minučių centrifuguojamos esant 3500 aps / min. Naudokite nuosėdas kultūrinei terpei pasėti.

Gerklų tamponu

Tamponas turi būti dedamas į sterilų mėgintuvėlį, kuriame yra lygios dalys distiliuoto vandens ir 4% NaOH. Tamponas turi būti prispaustas prie vamzdelio sienelių, kad mėginys praskiedžiamas skystyje. Centrifuguokite ir naudokite nuosėdas. Neutralizuokite nuosėdas, kaip jau aprašyta.

Sėjama

Löwenstein-Jensen terpė pasėjama įpilant 0,5 ml mėginio į terpės paviršių. Pasukite mėgintuvėlį, kad mėginys pasiskirstytų terpėje. Nenaudokite platinos rankenos.

Antrąjį mėgintuvėlį, kuriame yra „Stonebrink“ terpė, galima pasėti, kad būtų galima išskirti Mycobacterium bovis ir kitas rūšis, kurios neauga ant Löwenstein-Jensen terpės.

Inkubacija

Inokuliuoti mėgintuvėliai inkubuojami aerobiškai 37 ° C temperatūroje, kai dangtelis yra šiek tiek laisvas, maždaug 5 ° pakreiptas ir apsaugotas nuo šviesos. Aplinka gali būti praturtinta 5–10% anglies dioksido. Du kartus per savaitę tikrinkite kultūras, kol atsiras kolonijų.

Kai mėginys absorbuotas, dangteliai užveržiami. Maksimalus inkubacijos laikas yra 8 savaitės, jei po to laiko augimo nėra, jis nurodomas kaip neigiamas.

QA

Kokybės kontrolei gali būti naudojamos šios padermės:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus PyogeCC 196C, 1963, Streptococcus PyogeCoccoccus.

Tikimasi puikaus trijų pirmųjų paminėtų rūšių vystymosi, nes M. fortuitum augimas turėtų būti geras, o M. bovis augimas tikėtinas mažai arba jo visai nėra. Tuo tarpu kitos rūšys, išskyrus Mycobacterium gentį, turi būti visiškai slopinamos.

Apribojimai

Paruošta terpė turi būti apsaugota nuo šviesos, dėl ilgalaikio šviesos poveikio terpė tampa nuo žalios iki mėlynos, tokiu atveju terpė nebegalima būti naudojama. Taip yra todėl, kad malachito žalia yra jautri šviesai.

Terpė, nes joje yra kiaušinių, gali būti lengvai užteršta, jei ji nebus tvarkoma aseptiškai. Jį galima ištirpinti, jei jis bus užterštas proteolitinėmis bakterijomis.

„Mycobacterium“ genties bakterijoms auginti ir joms tvarkyti reikalingas kvalifikuotas personalas, žinantis apie biologinio saugumo priemones, kurių reikia laikytis norint išvengti užteršimo ar neužteršimo kitais.

HCl neturėtų būti naudojamas neutralizavimo etape dėl natrio chlorido susidarymo, kuris gali būti toksiškas Kocho bacilai.

Mėginiai turi būti laikomi šaldytuve ir neapdoroti.

Nuoroda

1. Francisco Soria Melguizo laboratorijos. 2009. Löwenstein-Jensen selektyvioji terpė. Galima rasti: f-soria.es
2. „Britannia“ laboratorijos. 2017. Löwenstein-Jensen terpė. Galima rasti: britanialab.com.
3. Neogenų laboratorijos. Löwenstein-Jensen terpė. Galima rasti svetainėje: foodsafety.neogen.com.
4. „Löwenstein-Jensen terpė“. Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2018 m. Lapkričio 20 d., 15:15 UTC. 2019 m. Balandžio 24 d., 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5-asis leidimas Redakcija Panamericana SA Argentina.
6. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey ir Scotto mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Redakcija Panamericana SA Argentina.
7. Macas Faddinas J. (2003). Biocheminiai tyrimai klinikinės svarbos bakterijoms nustatyti. 3-asis leidimas Redakcija Panamericana. Buenos Airės. Argentina.