KATALAZĖS TESTAS: PAGRINDIMAS, TECHNIKA IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Katalazės testas yra metodika, bakteriologijos laboratorijos atskleisti fermento katalazės buvimą tuose bakterijų, kad turėti tai. Kartu su dėme „Gram“ jie yra pagrindiniai bandymai, kuriuos reikėtų atlikti naujai išskirtiems mikroorganizmams. Šie testai mikrobiologui nurodo veiksmus, kurių reikia imtis norint galutinai identifikuoti aptariamą mikroorganizmą.

Apskritai bakterijos, turinčios citochromo, turi fermentą katalazę, o tai reiškia, kad fakultatyviosios aerobinės ir anaerobinės bakterijos turėtų jį turėti. Tačiau yra ir išimčių, tokių kaip Streptococcus, kurios, nepaisant fakultatyvių anaerobinių mikroorganizmų, neturi fermento katalazės.

Atliekame katalazės testą, parodant teigiamą reakciją. Šaltinis: nepateiktas mašininio skaitymo autorius. Nase prisiėmė prielaidą (remdamasi pretenzijomis dėl autorių teisių).

Štai kodėl katalazės testas pirmiausia naudojamas atskirti Staphylococaceae ir Micrococaceae šeimas (abi teigiamos katalazės atžvilgiu) iš Streptococaceae šeimos (katalazės neigiamos).

Panašiai, be kita ko, Bacillus gentis (teigiama catalazė) skiriasi nuo Clostridium genties (catalazės neigiama).

Pagrindas

Katalazė yra fermentas, klasifikuojamas kaip hidroperoksidazė, tai reiškia, kad jie kaip substratą naudoja vandenilio peroksidą (H ₂ O ₂ ).

Ji taip pat laikoma oksidoreduktaze, nes reakcijoje, kurioje ji dalyvauja, yra elementas, kuris tarnauja kaip elektronų donoras (redukuojanti medžiaga), o kitas - kaip elektronų receptorius (oksiduojanti medžiaga).

Katalazė yra baltymas, turintis proserinę grupę su keturiais trivalenčiais geležies atomais (Fe ⁺⁺⁺ ), todėl tai yra homoproteinas. Geležies jonas reakcijos metu išlieka oksiduotas.

Galima sakyti, kad katalazė yra detoksikuojantis fermentas, nes jos funkcija yra pašalinti medžiagas, kurios susidaro bakterijų apykaitos metu ir yra toksiškos bakterijoms. Tarp šių medžiagų yra vandenilio peroksidas.

Vandenilio peroksidas susidaro suskaidžius cukrų aerobiniu būdu. Šis procesas vyksta taip:

Superoksido jonas (O ₂ ^- ) (laisvasis radikalas) susidaro kaip galutinis gliukozės asimiliacijos aerobiniu būdu produktas. Tai yra toksiška ir yra pašalinama fermento superoksido dismutazės, kuri paverčia jį dujiniu deguonimi ir vandenilio peroksidu.

Vandenilio peroksidas taip pat yra toksiškas bakterijoms ir turi būti pašalintas. Fermento katalazė skaido vandenilio peroksidą į vandenį ir deguonį.

Katalazė gali veikti kitus nei vandenilio peroksidas substratus, tokius kaip alkoholiai, aldehidai, rūgštys, aromatiniai aminai ir fenoliai. Tačiau vandenilio peroksidą taip pat gali naudoti katalazė, kad oksiduotų kitus toksinius junginius, tokius kaip metilo ir etilo alkoholis.

Taip pat katalazė yra fagocitinėse ląstelėse, apsaugodama ją nuo toksinio vandenilio peroksido poveikio.

Įprastinė katalazės tyrimo metodika

-Slydimo metodas

medžiagos

3% vandenilio peroksido (10 tūrių).

Mikroskopo skaidrė

Vienkartinė plastikinė rankena arba medinis dantų krapštukas.

Procesas

Paimkite pakankamai kolonijos, kad galėtumėte studijuoti, neliesdami agaro, iš kurio ji kilo. Kolonija turi būti šviežia, ty 18–24 valandų kultūra.

Koloniją padėkite ant sauso stiklelio ir įlašinkite į jį lašą 3% vandenilio peroksido (taip pat gali būti naudojamas 30% H ₂ O ₂ ). Nedelsdami stebėkite, ar išsiskiria burbuliukai.

Interpretacija

Teigiama reakcija: dujų išsiskyrimas, kurį patvirtina burbuliukų susidarymas (stiprus burbuliavimas).

Neigiama reakcija: nesusidaro burbulas.

-Tiesioginis metodas grynojoje kultūroje

Į gryną lėkštę arba pleišto kultūrą, kurioje nėra kraujo (geriausia maistinio agaro), įpilkite 1 ml 3% H ₂ O ₂ . Stebėkite, ar iškart susidaro burbulas. Taip pat gali būti naudojamas 30% H ₂ O ₂ .

Jis aiškinamas taip pat kaip porta objekto metodas.

- Metodas su kapiliariniu vamzdeliu arba Fung ir Petrishko

Kapiliarinis 67 mm kapiliarinis vamzdelis užpildomas 3% vandenilio peroksidu.

Kapiliarą, užpildytą 3% H ₂ O _2, palieskite tiriamą izoliuotą koloniją _. Stebėkite, ar kapiliaras užpildo burbulus maždaug per 10 sekundžių. Šis metodas leidžia pusiau kiekybiškai įvertinti kryžminę reakciją:

Be kryžių nėra burbuliukų (neigiama reakcija).

+ ---- Nedaug burbuliukų (silpna arba uždelsta reakcija).

++ --– gausu burbuliukų (vidutinio sunkumo reakcija).

+++ - burbuliukai pasiekia priešingą galą (stipri reakcija).

-Taylor ir Achanzar metodas katalazės tyrimams, kurie suteikia abejonių

Padėkite izoliuotą koloniją ant švarios, sausos plokštelės, tada įlašinkite 0,5% H ₂ O ₂ lašo ir uždenkite dangteliu. Stebėkite, ar nėra įstrigusių burbuliukų.

Aiškinimas: burbuliukų buvimas rodo teigiamą reakciją. Nėra burbulų, jis aiškinamas kaip neigiama reakcija.

Katalazės tyrimas Mycobacterium rūšims

Ši technika turi būti atliekama kontroliuojant pH ir temperatūrą. Jis turi būti atliekamas po laminarinio srauto gaubtu, nes manipuliavimas skirtingomis Mycobacterium rūšimis yra pavojingas.

-Medžiagos

30% arba 110 tūrio vandenilio peroksidas (superoksalas).

Fosfato buferis, pH 7

10% Tween 80

Mycobacterium pleišto kultūra 3 - 4 savaites

-Paruošimas

Fosfato buferis, pH 7

Sverti:

1,361 g bevandenio monokalio fosfato (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 g bevandenio dinatrio (Na2HPO3) fosfato.

Abi druskos ištirpinkite mažai steriliame distiliuotame vandenyje ir praskieskite vandeniu iki 1000 ml.

10% Tween 80

Tirpalu koncentruotame Tween 80 skiedžiame santykiu 1:10, kad tai atliktume taip:

Paimkite 1 ml Tween 80 ir įpilkite į mažai distiliuoto vandens, ištirpinkite ir praskieskite vandeniu, kad tūris būtų 10 ml.

Galutinis reagentas

Sumaišykite fosfato buferio kiekį su 10% Tween 80 kiekiu (lygiomis dalimis). Laboratorijoje apibrėžkite, kiek norite paruošti.

-Procesas

Į sterilų užsukamą mėgintuvėlį (bakelitą) įpilkite 5 ml fosfato buferio.

Su inokuliacijos kilpa paimkite pakankamai Mycobacterium augimo kolonijos, pasėtos pleištais, ir ištirpinkite fosfato buferyje.

Uždenkite vamzdelį, pernelyg neužverždami sriegio. Įdėkite į 68–30 ° C vandens vonią 20–30 minučių. Išimkite ir leiskite atvėsti iki 22–25 ° C

Išmatuokite 0,5 ml galutinio reagento (sumaišykite) ir įpilkite į mėgintuvėlį šaltu tirpalu. Stebėkite, ar nėra burbuliukų.

Tai aiškinama taip pat, kaip ir ankstesni metodai.

Naudokite

Gaunant kolonijas praturtintose terpėse, gautoms kolonijoms reikia atlikti Gram dažymą ir katalazės testą. Tai padės mikrobiologui nustatyti procedūras, kurių reikia norint nustatyti.

Šaltinis: Parengė autorė MSc. Marielsa gil

QA

Norint įvertinti gerą vandenilio peroksido reagento veiksmingumą, naudokite šviežiai kultivuojamas kontrolines padermes, tokias kaip Staphylococcus aureus kaip teigiamą kontrolę, o Streptococcus sp padermes - kaip neigiamą kontrolę.

Kita alternatyva, naudojama kaip teigiama kontrolė, yra lašinti vandenilio peroksido lašą į kraujo agarą, eritrocitai turi katalazę, todėl jei burnoje bus geros būklės, susidarys burbuliukai.

Šokolado agaras gali būti naudojamas kaip neigiama kontrolė, čia eritrocitai jau lizuojami, o testas neigiamas.

Apribojimai

- Nenaudokite senų kultūrų bandymui, nes tai gali sukelti klaidingų negatyvų.

- venkite kolonijų paėmimo iš kultūrų kraujo agare, jei esate atsargūs ir neliesite agaro; Ši procedūra gali sukelti klaidingą teigiamą rezultatą, nes eritrocituose yra katalazės.

-Jei imsitės kolonijos su platinos rankena, nekeiskite procedūros eilės, nes tai gali sukelti klaidingų teigiamų rezultatų. Taip yra todėl, kad platina sugeba reaguoti su vandenilio peroksidu, sukeldama burbuliavimą.

-Nenaudokite vandenilio peroksido reagento, jei jis yra labai senas, nes reagentas yra labai nestabilus ir linkęs laikui bėgant suirti.

- Laikykite vandenilio peroksido reagentą, apsaugotą nuo šviesos ir šaldomą, kad nepažeistumėte.

- Kiekvieną kartą naudodamiesi, atlikite vandenilio peroksido reagento kokybės kontrolę.

-Atminkite, kad jei naudojamas 30% H ₂ O ₂ , reakcijos yra stipresnės nei tos, kurios vyksta su 3% H ₂ O ₂ .

Nuorodos

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5-asis leidimas Redakcija Panamericana SA Argentina.
2. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey ir Scotto mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Redakcija Panamericana SA Argentina.
3. Macas Faddinas J. (2003). Biocheminiai tyrimai klinikinės svarbos bakterijoms nustatyti. 3-asis leidimas Redakcija Panamericana. Buenos Airės. Argentina.
4. BD laboratorijos. Katalazės-Gotario reagentas. Galima rasti: http://winklerltda.cl
5. „Vadequímica“ laboratorijos. Peroksidas. Apimties ir procentų lygiavertiškumas. Galima rasti: vadequimica.com