OKSIDAZĖS TESTAS: PAGRINDIMAS, PROCEDŪRA IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Oksidazės testas yra diagnostinis metodas, kuris rodo, kad fermento komplekso vadinamas citochromo oksidazės c buvimas. Ši sistema skatina citochromo, paversto redukuotu iki oksidacijos, virsmą, nes jis surenka deguonį ir tai savo ruožtu veikia kaip paskutinis kvėpavimo grandinės elektronų akceptorius (H ⁺ ).

Terminas oksidazė yra sutrumpintas būdas paminėti fermentą citochromo oksidazę, dar žinomą kaip indofenolio oksidazė. Senovėje buvo manoma, kad fermentai citochromo oksidazė ir indofenolio oksidazė yra du skirtingi fermentai, tačiau šiandien žinoma, kad jie yra vienodi.

Teigiamas ir neigiamas oksidazės testas. Šaltinis: nepateiktas mašininio skaitymo autorius. Alfa.prim ~ commonswiki prielaida (pagrįsta autorių teisių paraiškomis).

Savo ruožtu citochromai yra hemoproteinai, kurių sudėtyje yra geležies ir užbaigia citochromo oksidazės sistemą. Citochromai gali skirtis atsižvelgiant į rūšis.

Yra įvairių citochromų veislių (citochromai a1, a2, a3 ir 0). Kai kurios bakterijos gali gaminti tik vieną, o kitos - ne daugiau kaip du ar tris vienu metu. Šia prasme citochromo a ir a3 buvimas žinomas kaip citochromo oksidazė c. Tai yra tas citochromo tipas, kurį nustato oksidazės testas.

Neisseria ir Pseudomonas genuose yra citochromo oksidazės c. Šios gentys suteikia teigiamą oksidazės testą ir padeda juos atskirti nuo Acinetobacter ir Stenotrophomonas genčių.

Taip pat yra ir kitų genų, kuriems teigiama oksidazė.

Pagrindas

Citochromo oksidazės c sistemos charakteristika

Citochromo oksidazės c sistema veikia taip: oksidazės teigiami mikroorganizmai naudoja deguonį energijai generuoti per aerobinį kvėpavimą. Ši sistema veikia dėka elektronų pernešimo iš donorų, tokių kaip NADH ^+, į receptorius, šiuo atveju deguonį.

Tai lemia energijos (ATP) ir vandens ar vandenilio peroksido gamybą, atsižvelgiant į citochromo oksidazės sistemą, kurią turi mikroorganizmas.

Štai kodėl dauguma teigiamų bakterijų, patenkančių į oksidazę, taip pat yra teigiamos katalazės - būtina sąlyga, norint pašalinti susidariusį vandenilio peroksidą, nes ši medžiaga yra toksiška bakterijoms.

Citochromo oksidazės c sistema yra kai kuriose aerobinėse bakterijose, kai kuriose fakultatyviuose anaerobuose, nedaugelyje mikroaerofilinių ir nėra griežtų anaerobų. Pastarasis yra suprantamas, nes griežti anaerobai negali gyventi esant deguoniui, todėl jiems trūksta citochromo oksidazės sistemos.

Testo principas

Šiame bandyme naudojamos medžiagos, veikiančios kaip dirbtiniai elektronų akceptoriai, pakeičiančios natūralias elektronų pernešimo grandinėje.

Dažniausiai naudojami dažikliai, tokie kaip parafenilendiaminas ir indofenolis, kurie veikia kaip receptorių substratai ir dirbtiniai elektronų donorai.

Pafenilendiaminas oksiduojasi citochromo oksidazės c sistema. Savo sumažinta forma dažai yra bespalviai, tačiau oksiduotu pavidalu jie yra spalvoti.

Taip įrodo citochromo oksidazės c sistemos buvimas; nes teigiama reakcija lemia levandos arba mėlynos-violetinės spalvos spalvą, atsižvelgiant į naudojamą reagentą.

Kita vertus, jei paskutinė elektronus priimanti medžiaga kvėpavimo grandinėje skiriasi nuo deguonies, oksidazės testas bus neigiamas (nėra spalvų susidarymo); taip yra su anaerobiniais mikroorganizmais.

Panašiai, jei mikroorganizmo naudojamas citochromas skiriasi nuo citochromo oksidazės c, tai testas taip pat bus neigiamas.

Procesas

Oksidazės tyrimui yra įvairių reagentų ir protokolų, visi skirti tam pačiam tikslui.

Reagentai

Kovacso reagentas, Gordono ir McLeodo reagentai, Nadi reagentas, Carpenterio, Suhrlando ir Morrisono reagentas ir oksidazės diskų naudojimas.

-Kovacs oksidazės reagentas

Jį sudaro 1% tetrametil-p-fenilendiamino dihidrochloridas.

Kovacs reagentas gaunamas ištirpinant 1 g aukščiau paminėtos medžiagos 50 ml distiliuoto vandens. Jis kaitinamas subtiliai, kol visiškai ištirps. Įpilkite į pakankamai gintaro buteliuką ir praskieskite distiliuotu vandeniu iki 100 ml. Prieš naudojimą palaukite bent 15 minučių. Laikyti šaldytuve, apsaugotoje nuo šviesos.

Jis yra pažymėtas Kovacs oksidazės reagentu, kad būtų galima atskirti jį nuo Kovacs reagento, naudojamo indolo bandymui atskleisti. Šis reagentas yra jautriausias, mažiau toksiškas, bet brangesnis už likusius reagentus.

Teigiama reakcija bus parodyta naudojant šį reagentą, kol kolonijos spalva pasikeis į levandą, kuri greitai pasidaro purpurinė beveik juoda. Neigiama reakcija akivaizdi, nes kolonijoje spalva nesikeičia arba ji įgauna silpną rausvą spalvą. Terpė taip pat gali patamsėti, tačiau tai nereiškia teigiamos reakcijos.

Naudojant šį reagentą, reakcijos laikas yra lemiamas, spalvos pasikeitimas, vykstantis nuo 5 iki 15 sekundžių, laikomas teigiama reakcija.

-Gordono ir McLeodo reagentas

Jį sudaro dimetil-p-fenilendiamino dihidrochloridas, dar žinomas kaip N-dimetil-p-fenilendiaminas arba p-aminodimetilalanilino monohidrochloridas. Jis paruošiamas taip, kaip aprašyta Kovacso oksidazės reagentui, pakeičiant dalyvaujančią medžiagą.

Šis reagentas yra šiek tiek stabilesnis nei Kovacso oksidazės reagentas, nors visi reagentai, kurių sudėtyje yra p-fenilendiamino, yra nestabilūs.

Ši reakcija yra vėliau, ji aiškinama kaip teigiama, kai per 10–30 minučių atsiranda mėlynai violetinė spalva.

-Nadi reagentas

Jį sudaro 1% α-naftolas etilo alkoholyje (95% etanolio) ir 1% aminodimetilalanilinas. Mišinys paruošiamas lygiomis dalimis, naudojant skiediklį absoliutų etilo alkoholį, kol bus užpildyta pakankama 100 ml koncentracija.

-Karpenterio, Suhrlando ir Morrisono reagentas

Jį sudaro 1% p-aminodimetilalanino oksalato. Paruoškite taip, kaip aprašyta Kovacs oksidazės reagentui, pakeisdami atitinkama medžiaga.

Kai tirpalas paruoštas, bandymo juostelės paruošiamos taip: 6-8 cm Whatmano Nr. 1 filtravimo popieriaus juostelės yra įmirkytos 1% dimetil-p-fenilendiamino oksalato reagentu.

Jiems leidžiama išdžiūti nesiliečiant su metalu, laikyti užkimštuose indeliuose su sausikliu ir laikyti šaldytuve. Šios juostelės yra stabilios iki 6 mėnesių.

Tai yra stabiliausias reagentas iš visų minėtų ir tirpale gali išlikti iki 6 mėnesių. Kitas pliusas yra tas, kad jis nedažys terpės aplink koloniją, jei ji naudojama tiesiai ant plokštelės.

Raudonos spalvos išvaizda aiškinama kaip teigiamas testas.

-Oksidazės diskai

Tai yra komerciniai diskai, įmirkyti reagentu oksidazės tyrimui. Rinkoje yra keletas prekinių ženklų.

Jo naudojimas yra gana praktiškas, nes nereikia ruošti šviežių reagentų, o tai palengvina darbą. Gauti rezultatai yra patikimi tol, kol diskai yra tinkamai išsaugoti.

Protokolai

Tiesioginis plokštelės metodas, netiesioginis metodas ant popieriaus ir diskų, įmirkytų oksidazės reagentais, naudojimas.

-Tiesioginis plokštės metodas

Šiuo tikslu į koloniją (kolonijas), esančią kultūrinės terpės plokštelėje, kurioje nėra gliukozės, įpilama 2 arba 3 lašai bet kurio iš aukščiau paminėtų reagentų.

Aiškinamas kolonijų spalvos pasikeitimas ar pasikeitimas, o ne terpė. Galiojantis reakcijos laikas priklauso nuo naudojamo reagento.

-Tiesioginis metodas popieriuje

Iškirpkite 6 cm ² dydžio filtravimo popieriaus gabalą (Whatman Nr. 1) ir padėkite jį į tuščią Petri lėkštelę.

Ant popieriaus įlašinkite 2 arba 3 lašus Kovacs oksidazės reagento, dalį tiriamos kolonijos paimkite platinos rankena arba mediniu dantų krapštuku ir tiesia linija paskirstykite ant reagentais impregnuoto popieriaus. Išaiškinkite per 5–10 sekundžių.

Juostelėmis, paruoštomis naudojant Carpenter, Suhrland ir Morrison reagentus, kolonija paskleidžiama ant sausos juostelės. Kelioms padermėms patikrinti naudojama viena juostelė. Vertimas per 10 sek.

-Diskai (m

Subtiliai sudrėkinkite komercinius diskus steriliu distiliuotu vandeniu ir uždėkite ant tiriamos kolonijos. Plokštes rekomenduojama naudoti 35 ° C temperatūroje, jei naudojamos plokštelės kambario temperatūroje arba šaldomos plokštelės, reakcija būna šiek tiek lėtesnė. Interpretuokite spalvų pokytį nuo 10 iki 20 sek.

Gali būti naudojamos kraujo kolonijos arba šokolado agaras.

-Diskai (netiesioginis metodas)

Sumažinkite diską, kaip aprašyta anksčiau. Sudėkite į tuščią Petri lėkštelę. Paimkite pakankamą kolonijos kiekį tyrimui su platinos rankena arba mediniu dantų krapštuku ir padėkite ant disko. Interpretuokite spalvų pokytį nuo 10 iki 20 sek.

Naudokite

Neisseria ir Acinetobacter genties morfologija kartais yra labai panaši, nes, nors Acinetobacter gentis yra gramneigiamas lazdele, kartais ji gali būti kokoso formos ir pasiskirstyti poromis, imituodama Neisseria gentį.

Šiuo atveju oksidazės testas yra tikrai naudingas. Neisseria gentis yra teigiamas, o Acinetobacter - neigiamas.

Tačiau Moraxella gentis yra labai panaši į Neisseria gentį ir abu sukelia teigiamą reakciją; Štai kodėl angliavandenių fermentacijos testai visada turi būti atlikti, kad būtų galima galutinai identifikuoti.

Kita vertus, oksidazės testas yra naudingas norint atskirti Enterobacteriaceae šeimai priklausančią bakteriją (visos oksidazės neigiamos) nuo kitų fermentų, tokių kaip Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (teigiamos oksidazės teigiamos genties).

Vibrio ir Helicobacter gentys taip pat yra teigiamos oksidazės.

QA

Naudokite žinomas Escherichia coli padermes kaip neigiamą kontrolę, o Pseudomonas aeruginosa padermes - kaip teigiamą kontrolę.

Apribojimai

- Reagentai turi būti naudojami šviežiai paruošti, jų laikymo laikas tirpale kambario temperatūroje yra trumpas, nes jie yra labai nestabilūs. Šaldytuve jie gali trukti nuo 5 dienų iki 2 savaičių.

- Reagentai yra bespalviai, jei jie keičia spalvą, jie turi būti išmesti. Pažeisti diskai rodomi, nes laikui bėgant jie tamsėja.

- Teigiama 15–60 sek. Reakcija su Kovacs oksidazės reagentu laikoma uždelsta reakcija, o po 60 sekundžių - neigiama.

-Haemophylus influenzae sukelia neigiamą oksidazės reakciją, jei naudojamas bet kuris reagentas su dimetil-p-fenilendiaminu, bet teigiamas, jei naudojamas Kovacso oksidazės reagentas (tetrametil-p-fenilendiaminas).

-Mediumai, kuriuose yra gliukozės, trukdo atlikti testą ir suteikia klaidingų neigiamų rezultatų.

-Bordetella pertussis padermės gali sukelti klaidingą teigiamą reakciją, jei jos kilusios iš labai koncentruotos kraujo agaro plokštelių.

-Naudojant metalines (geležines) rankenas, gaunama klaidinga teigiama reakcija.

rekomendacijas

- Kadangi reagentai yra labai nestabilūs ir linkę savaime oksiduotis, rekomenduojama užšaldyti 1–2 ml alikvotus ir prireikus pašalinti.

-Kitas būdas atidėti reagento autooksidaciją yra 0,1% askorbo rūgšties pridėjimas ruošiant reagentus.

- Kadangi reagentai yra nestabilūs, rekomenduojama kas savaitę atlikti kokybės kontrolę.

-Ragentai, kurie neišlaiko kokybės kontrolės testo, neturėtų būti naudojami.

Nuorodos

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5-asis leidimas Redakcija Panamericana SA Argentina.
2. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey ir Scotto mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Redakcija Panamericana SA Argentina.
3. "Oksidazės testas". Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2018 sausio 15, 10:32 UTC. 2019 m. Balandžio 3 d., 14:03
4. Pasaulio Sveikatos Organizacija. Laboratorinis vadovas, nustatantis ir tiriantis visuomenės sveikatos požiūriu svarbius bakterinius patogenus antimikrobiniams vaistams besivystančiame pasaulyje, 2004 m. Galima rasti: who.int/drugresistance/infosharing
5. Reagento juostelės bakterijų oksidazės aktyvumui diagnozuoti. „Cubana Med Trop“. 2000; 52 (2): 150–151.