CITOCHEMIJA: ISTORIJA, TYRIMO OBJEKTAS, NAUDINGUMAS IR METODAI - BIOLOGIJA - 2025

Cytochemistry apima įvairius metodus, kurie remiasi nustatymo ir disponavimo specifinių medžiagų ląstelės viduje seriją. Tai laikoma ląstelių biologijos šaka, kurioje ląstelių morfologija derinama su chemine struktūra.

Pasak Bensley, šiuolaikinės citologijos taikymo įkūrėjo, jis išreiškia, kad citochemijos tikslas yra atrasti cheminę ląstelių organizaciją, kad būtų galima suprasti gyvenimo paslaptis. Taip pat tiriami dinaminiai pokyčiai, atsirandantys skirtinguose funkciniuose etapuose.

1: Paget'o neakivaizdinė liga. (Hematoksilinas-eozinas) 2: senatvinės plokštelės, pastebimos paciento, sergančio Alzheimerio liga, smegenų žievėje. (Sidabro impregnavimas) 3: Triušio liežuvis, kolageno skaidulos (mėlynos spalvos). Raumenų pluoštai (purpurinės juostelės). (Masson trichromas). 4: Kepenų audinys, turintis riebalinį degeneraciją. (Sudanas III) 5: Uždegusios kepenys. Nekrozė. (Toluidino mėlynasis) Šaltiniai: Vikipedija. com / Vartotojas: KGH / Public Domain failai / Mohit Lalwani

Tokiu būdu galima nustatyti šių medžiagų metabolinį vaidmenį ląstelėje.

Citochemija naudoja du pagrindinius metodus. Pirmasis yra pagrįstas cheminėmis ir fizinėmis procedūromis. Šie metodai yra naudojami kaip mikroskopas kaip nepakeičiama priemonė, norint vizualizuoti chemines reakcijas, kurios vyksta su konkrečiomis medžiagomis ląstelėje.

Pavyzdys: citocheminių dažų, tokių kaip Feulgeno arba PAS reakcija, naudojimas, be kita ko.

Antrasis metodas pagrįstas biochemija ir mikrochemija. Taikant šią metodiką galima kiekybiškai nustatyti tarpląstelinių chemikalų buvimą.

Tarp medžiagų, kurios gali atsiskleisti audinių ar ląstelių struktūroje, yra šios: baltymai, nukleorūgštys, polisacharidai ir lipidai.

Citochemijos istorija

Citocheminiai metodai nuo jų išradimo padėjo suprasti ląstelių sudėtį, o laikui bėgant atsirado daugybė metodų, naudojančių įvairių tipų dažus, turinčius skirtingą giminingumą ir pagrindus.

Vėliau, naudojant tam tikrus substratus, citochemija atvėrė naujus horizontus, kad kolorimetriškai parodytų fermentų ar kitų molekulių buvimą ląstelėje.

Panašiai atsirado ir kitų metodų, tokių kaip imunocitochemija, kuri labai padėjo diagnozuojant daugelį ligų. Imunocitochemija yra pagrįsta antigeno-antikūnų reakcijomis.

Kita vertus, citochemijoje taip pat buvo naudojamos fluorescencinės medžiagos, vadinamos fluoro chromais, kurios yra puikūs žymekliai tam tikroms ląstelių struktūroms nustatyti. Dėl fluorochromo savybių jis pabrėžia struktūras, prie kurių jis buvo pritvirtintas.

Ką tu studijuoji?

Įvairūs citocheminiai metodai, naudojami biologiniame mėginyje, turi kažką bendro: jie atskleidžia konkretaus tipo medžiagos buvimą ir žino jos vietą vertinamoje biologinėje struktūroje, nesvarbu, ar tai ląstelių tipas, ar audinys.

Šios medžiagos gali būti fermentai, sunkieji metalai, lipidai, glikogenas ir apibrėžtos cheminės grupės (aldehidai, tirozinas ir kt.).

Šių metodų teikiama informacija gali padėti ne tik atpažinti ląsteles, bet ir diagnozuoti įvairias patologijas.

Pavyzdžiui, citocheminės dėmės yra labai naudingos diferencijuojant įvairius leukemijų tipus, nes kai kurios ląstelės ekspresuoja tam tikrus fermentus ar pagrindines medžiagas, o kitos - ne.

Kita vertus, reikia pažymėti, kad norint naudoti citochemiją, reikia atsižvelgti į šiuos dalykus:

1) Medžiaga turi būti imobilizuota toje vietoje, kur yra natūraliai.

2) Medžiaga turi būti identifikuojama naudojant substratus, kurie reaguoja konkrečiai su ja, o ne su kitais junginiais.

Naudingumas

Mėginiai, kuriuos galima ištirti taikant citocheminius metodus, yra šie:

- išplėstas periferinis kraujas.

- prailgintos kaulų čiulpai.

- Histocheminiams metodams nustatyti audiniai.

- Ląstelės, fiksuotos citocentrifugavimo būdu.

Citocheminiai metodai labai palaiko hematologiją, nes jie plačiai naudojami siekiant padėti diagnozuoti ir diferencijuoti tam tikrų rūšių leukemijas.

Pvz .: Esterazės reakcijos yra naudojamos norint atskirti mielomonocitinę leukemiją nuo ūminės monocitinės leukemijos.

Šių pacientų kaulų čiulpų ir periferinio kraujo tepinėliai yra panašūs, nes kai kurias ląsteles sunku nustatyti vien morfologiškai. Tam atliekamas esterazės testas.

Pirmosiose specifinės esterazės yra teigiamos, o antrosios - nespecifinės esterazės yra teigiamos.

Jie taip pat yra labai naudingi histologijoje, nes, pavyzdžiui, naudojant sunkiųjų metalų dažymo metodą (impregnavimas sidabru), miokardo audinyje dažomi intensyvios rudos spalvos tinklainės pluoštai.

Citochemijos metodai

Žemiau paaiškinami dažniausiai naudojami metodai:

- Dažiklių naudojimas

Citocheminiuose metoduose naudojamos dėmės yra labai įvairios ir jas galima klasifikuoti pagal keletą požiūrių:

Pagal radikalą, kuriam jie yra artimi

Jie skirstomi į: rūgščius, šarminius arba neutralius. Jie yra patys paprasčiausi ir labiausiai naudojami per visą istoriją, leidžiant atskirti bazofilinius komponentus nuo acidofilinių. Pavyzdys: hematoksilino-eozino dažymas.

Tokiu atveju ląstelių branduoliai nusidažo mėlynai (jie paima hematoksiliną, kuris yra pagrindinis dėmė), o citoplazmos - raudonai (jie paima eoziną, kuris yra rūgšties dėmė).

Pagal jų teikiamą spalvą

Jie gali būti ortchromatiniai arba metachromatiniai. Ortodromatinės medžiagos yra tos, kurios dažo tos pačios spalvos struktūras, kokias turi dažai. Pavyzdžiui, eozino, kurio spalva yra raudona ir nusidažo raudona spalva.

Kita vertus, metachromatiniai dažai struktūriškai skiriasi nuo jų, pavyzdžiui, toluidino, kurio spalva yra mėlyna, o violetinė.

Gyvybingi arba supravitaliniai dažai

Jie yra nekenksmingi dažai, tai yra, dažo ląsteles ir lieka gyvi. Šios dėmės yra vadinamos gyvybiškai svarbiomis (pvz., Tripano mėlyna, norint nudažyti makrofagus) arba supravitalinėmis (pvz., Janus žalia, kad dažytų mitochondrijas, arba neutralios raudonos, kad dėmėtų lizosomas).

- Lipidų aptikimas naudojant riebaluose tirpius dažus

Osmio tetroksidas

Jis dažo lipidus (nesočiųjų riebiųjų rūgščių) juodai. Šią reakciją galima stebėti naudojant šviesos mikroskopą, tačiau kadangi šie dažai yra didelio tankio, juos galima vizualizuoti ir elektroniniu mikroskopu.

Sudanas III

Tai yra vienas iš labiausiai naudojamų. Šie dažai pasklinda ir tirpsta audiniuose, kaupdamiesi lipidų lašelių viduje. Spalva raudonai raudona.

Sudano juoda dėmė B

Jis sukuria geresnį kontrastą nei ankstesnieji, nes taip pat gali ištirpti fosfolipiduose ir cholesterolyje. Tai naudinga norint nustatyti azurofilines ir specifines subrendusių granulocitų granules ir jų pirmtakus. Todėl jis nustato mieloidinę leukemiją.

- Aldehido grupės dažymas (periodinė rūgštinė Schifo spalva)

Periodiškai rūgšties Schiff dėme galima aptikti trijų tipų aldehidų grupes. Jie yra:

- laisvieji aldehidai, natūraliai esantys audiniuose (reakcija į plazmą).

- Aldehidai, gaunami selektyvios oksidacijos būdu (PAS reakcija).

- Aldehidai, susidarantys selektyvios hidrolizės metu (Feulgeno reakcija).

PAS reakcija

Šis dažymas pagrįstas tam tikrų tipų angliavandenių, tokių kaip glikogeno, nustatymu. Periodinė rūgštis Schiff nutraukia angliavandenių CC ryšius dėl 1-2 glikolio grupių oksidacijos, sugebėdama išlaisvinti aldehido grupes.

Laisvos aldehido grupės reaguoja su Šifo reagentu ir sudaro purpuriškai raudoną junginį. Purpuriškai raudonos spalvos išvaizda rodo teigiamą reakciją.

Šis testas yra teigiamas augalų ląstelėse, nustatant krakmolą, celiuliozę, hemiceliuliozę ir peptidus. Gyvūnų ląstelėse jis aptinka mucinų, mukoproteinų, hialurono rūgšties ir chitino.

Be to, jis yra naudingas diagnozuojant limfoblastinę leukemiją ar eritroleukemiją, be kitų mielodisplastinio tipo patologijų.

Rūgštingiems angliavandeniams galima naudoti alciano mėlynos spalvos dėmę. Testas yra teigiamas, jei pastebima šviesiai mėlyna / turkio spalva.

Plazminė reakcija

Plazmos reakcija parodo tam tikrų ilgos grandinės alifatinių aldehidų, tokių kaip palmių ir stearalų, buvimą. Ši metodika taikoma užšaldytoms histologinėms dalims. Jis apdorojamas tiesiogiai Schiffo reagentu.

Felogeninė reakcija

Ši technika nustato DNR buvimą. Metodas susideda iš fiksuoto audinio silpnos rūgšties hidrolizės, kad vėliau jis galėtų reaguoti su Schiffo reagentu.

Hidrolizė atskleidžia dezoksiribozės aldehido grupes deoksiribozės-purino jungtyje. Tada Schiffo reagentas reaguoja su aldehido grupėmis, kurios liko laisvos.

Ši reakcija yra teigiama branduoliuose ir neigiama ląstelių citoplazmose. Pozityvumą rodo raudonos spalvos buvimas.

Jei ši metodika derinama su metilo žaliu-pironinu, įmanoma vienu metu aptikti DNR ir RNR.

- Baltymų struktūrų citocheminės dėmės

Tam gali būti naudojama Millono reakcija, kurioje kaip reagentas naudojamas gyvsidabrio nitratas. Aromatinių aminorūgščių turinčios struktūros nusidažys raudonai.

- Citocheminės dėmės, kurios naudoja substratus, kad parodytų fermentų buvimą

Šios dėmės yra pagrįstos biologinio mėginio inkubavimu su konkrečiu substratu, o reakcijos produktas vėliau reaguoja su diazo druskomis, sudarydamas spalvotą kompleksą.

Esterazės

Šie fermentai yra kai kurių kraujo ląstelių lizosomose ir yra pajėgūs hidrolizuoti organinius esterius, išskiriančius naftolį. Pastarasis suformuoja netirpius azo dažus, kai jungiasi su diazo druska, nudažydamas vietą, kur vyksta reakcija.

Yra keli substratai ir priklausomai nuo to, kuris naudojamas, galima nustatyti specifines esterazes ir nespecifines esterazes. Pirmųjų jų yra nesubrendusiose mieloidinės serijos ląstelėse, o antrųjų - monocitinės kilmės ląstelėse.

Substratas, naudojamas specifinėms esterazėms nustatyti, yra: naftolas-AS-D chloroacetatas. Nespecifinėms esterazėms nustatyti gali būti naudojami keli substratai, tokie kaip naftilo AS-D acetatas, alfa naftilacetatas ir alfa naftilo butiratas.

Abiem atvejais ląstelės bus tamsiai raudonos, kai reakcija bus teigiama.

Mieloperoksidazė

Šis fermentas randamas azurofilinėse granulocitų ir monocitų granulėse.

Jo aptikimas naudojamas atskirti mieloidinės kilmės leukemijas nuo limfoidinių. Ląstelės, turinčios mieloperoksidazių, virsta ochra geltona.

Fosfatazės

Šie fermentai atpalaiduoja fosforo rūgštis iš skirtingų substratų. Jie skiriasi vienas nuo kito pagal substrato specifiškumą, pH ir inhibitorių bei inaktyvatorių veikimą.

Tarp geriausiai žinomų yra fosfomonoesterazės, hidrolizuojančios paprastus esterius (PO). Pavyzdys: šarminė fosfatazė ir rūgštinė fosfatazė, taip pat fosfamidazės, kurios hidrolizuoja ryšius (PN). Jie naudojami limfoproliferaciniams sindromams diferencijuoti ir plaukuotų ląstelių leukemijai diagnozuoti.

- Trichrominės spalvos

Maljero-Azano trichromas

Jie yra naudingi ląstelių citoplazmai atskirti nuo jungiamojo audinio skaidulų. Ląstelės dažosi raudonai, o kolageno skaidulos - mėlynai.

Masson trichromas

Tai naudinga taip pat, kaip ir ankstesnįjį, tačiau šiuo atveju ląstelės nusidažo raudonai, o kolageno skaidulos žalios.

- Dažai, kurie dažo specifines organeliles

Janusas Greenas

Jis selektyviai dažo mitochondrijas.

Sidabro druskos ir osmos rūgštis

Dažo Golgi aparatą.

Toluidino mėlyna

Dažo Nissi kūnus

Sidabro druskos ir PAS

Jie dažo tinklainės pluoštus ir pagrindinį sluoksnį.

Orceino ir fuksino rezorcinas

Jie dažo elastinius pluoštus. Su pirmaisiais jie dažomi rudai, o su antruoju - tamsiai mėlyna arba purpurine spalva.

- Kiti metodai, naudojami citochemijoje

Fluorescencinių medžiagų arba fluorochromų naudojimas

Yra metodų, kurie naudoja fluorescencines medžiagas tiriant struktūros vietą ląstelėje. Šios reakcijos vizualizuojamos specialiu mikroskopu, vadinamu fluorescencija. Pavyzdys: TFI metodas (netiesioginė imunofluorescencija).

Ląstelinių komponentų aptikimas imunocitochemija

Šie metodai yra labai naudingi medicinoje, nes jie padeda nustatyti tam tikrą ląstelių struktūrą ir taip pat ją kiekybiškai įvertinti. Ši reakcija pagrįsta antigeno ir antikūno reakcija. Pvz .: ELISA metodai (fermento imunologinis tyrimas).

rekomendacijas

- Norint įvertinti gerą dažų veiksmingumą, būtina naudoti kontrolinius tepinėlius.

- Citocheminiam dažymui turėtų būti naudojami švieži tepinėliai. Jei neįmanoma, juos reikia saugoti nuo šviesos ir laikyti 4 ° C temperatūroje.

- Reikia pasirūpinti, kad naudojamas fiksatorius nedarytų neigiamos įtakos tiriamai medžiagai. Kitaip tariant, reikia užkirsti kelią galimybei ją išgauti ar slopinti.

- Turi būti laikomasi fiksatorių naudojimo laiko, nes paprastai tai turėtų trukti tik sekundes, nes ilgesnis tepalo veikimas fiksatoriui gali sugadinti kai kuriuos fermentus.

Nuorodos

1. "Citochemija". Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2018 m. Birželio 30 d., 17:34 UTC. 2019 m. Liepos 9 d., 02:53 Galima rasti: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Miokardo tinklainių pluoštų metalo impregnavimo metodai: palyginamasis tyrimas. RFM 2002; 25 (2): 224–230. Galima rasti: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Rūgštinės fosfatazės citochemija: metodologiniai aspektai. Diagn. Biol., 200; 50 (2): 89–92. Galima rasti: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Ląstelių ir molekulių biologija. 11-asis leidimas. Redakcija „Ateneo“. Buenos Airės, Argentina.
5. Klasikinės ląstelių biologijos studijų priemonės. TP 1 (papildoma medžiaga) - ląstelių biologija. Galima rasti: dbbe.fcen.uba.ar