BAKTERIJŲ TEPINĖLIS: CHARAKTERISTIKOS IR PARUOŠIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Bakterijų tepinėlis yra plona plėvelė tepinėlis iš bakterijų mikroorganizmų suspensijos, kad yra pagamintas ant skaidrios stiklo plokštės ar skaidrių, stebėjimo pagal šviesos mikroskopu.

Plėvelė plėvelės pavidalu atliekama siekiant kuo labiau atskirti mikroorganizmus, nes jei jie yra sugrupuoti, stebėjimas nėra aiškus.

1 pav. Bakterijų tepinėlis, matytas skenavimo elektronų mikroskopu. Šaltinis: pixbay.com

Tiriant bakterijų kultūras, siekiant geriau jas išanalizuoti, naudojami tepinėlių paruošimo, fiksavimo ir dažymo būdai. Dėl mažo mikroorganizmų dydžio jų stebėjimui būtinai reikia naudoti optinį mikroskopą.

Optiniai mikroskopai yra pagrindiniai tepinėlių stebėjimo instrumentai. Jie naudoja optinius lęšius ir šviesą, leidžiančią žiūrėti į pavyzdžius dideliu padidinimu.

Apskritai, gyvos ląstelės neturi daugiausiai spalvotų struktūrų, matomos šviesos mikroskopu, jos yra bespalviai, skaidrūs pavyzdžiai, ir vidinis jų kontrastas ir aplinka yra labai nedidelis.

Stebėjimas paprastu šviesos lauko šviesos mikroskopu, nenaudojant papildomų pagalbinių dažymo metodų, yra labai ribotas ir naudojamas tik kai kuriais atvejais, pavyzdžiui, stebint mikroorganizmų judėjimą.

Norint optimaliai stebėti mikroorganizmus, reikia rasti pusiausvyrą tarp kontrasto ir skyros. Ląstelių detalės negali būti matomos mikroskopu, net ir esant dideliam skyriui; Dažikliai turi būti naudojami naudojant dažymo metodus, kurie suteikia kontrastą stebėjimui.

Geros kokybės bakterijų tepinėlio savybės

Puikus kontrastas

Puikiam kontrastui pasiekti yra modernūs mikroskopai, vadinami fazinio kontrasto mikroskopais, diferencinių trukdžių mikroskopai ir tamsaus lauko mikroskopai. Šis mikroskopo tipas yra naudojamas stebėti bakterijų struktūras, tokias kaip apvalkalai ir gijos, be kita ko.

Dažymas yra paprastas būdas padidinti kontrastą, kuris pasiekiamas šviesaus lauko mikroskopu. Taikant šią techniką, gali būti naudojamos skirtingos dėmės, kurios žymiai pagerina mikroskopinį stebėjimą.

Dėmės atliekamos tiesiai ant plokštelių, anksčiau išdžiovinamų ir pritvirtintų, ant tepinėlių ar mikroorganizmų suspensijų pailginimo ant plokštelių.

Geras taisymas

Fiksacija yra technika, naudojama ląstelių struktūroms išsaugoti; sukelia mikroorganizmų inaktyvaciją ir prilipimą prie stiklelio stiklelio. Yra skirtingi tvirtinimo būdai: terminis ir cheminis fiksavimas.

Šilumos fiksavimas

Tai yra plačiausiai naudojamas metodas stebėti bakterijų tepinėlius. Techniką sudaro bakterijų tepalo suspensijos praleidimas per žiebtuvėlio liepsną. Ši technika gali išsaugoti išorinę bakterijų morfologiją, tačiau sunaikina jų vidines struktūras.

Cheminis fiksavimas

Cheminiam fiksavimui naudojamos konservavimo cheminės medžiagos, tokios kaip formaldehidas arba formalinas, etanolis ir acto rūgštis. Cheminių fiksavimo priemonių naudojimo pranašumas yra tas, kad išsaugomos vidinės ląstelių struktūros mikroorganizmai.

2 pav. Kraujo tepinėlis. Šaltinis: Bobjgalindo, iš „Wikimedia Commons“

Geras dažymas

Dažniausiai dažomos anksčiau išdžiovintos ir fiksuotos tepinėlio spalvos yra teigiamas arba paprastas dažymas, diferencinis dažymas ir neigiamas dažymas. Taip pat yra specialių metodų, kaip dažyti tam tikras ląstelių struktūras (kapsulę, sporą, žiuželius).

Teigiamas ar paprastas dažymas

Teigiamas ar paprastas dažymas yra plačiausiai naudojama tepinėlių dažymo technika. Tam naudojami dažai, galintys jungtis prie tam tikrų mikrobų struktūrų, leidžiančių juos stebėti mikroskopu.

Šių dažų cheminė struktūra turi chromoforų grupes (spalvotą dalį) su kintamais dvigubais ryšiais ir viengubais ryšiais (konjugacija). Šie ryšiai savo ruožtu gali sukurti joninius arba kovalentinius ryšius su kai kuriomis ląstelių struktūromis.

Dažai, naudojami dažant teigiamai arba paprastai, yra cheminiai anilino dariniai (spalvotos organinės druskos).

Kita vertus, tarp dažiklių galime rasti tokius, kurių pH yra pagrindinis, o kitus - rūgštus.

Pagrindiniai dažikliai

Pagrindiniuose dažikliuose chromoforų grupė turi teigiamą elektrinį krūvį. Didžioji dauguma prokariotinių mikroorganizmų turi neutralų vidinį pH, o jų ląstelių paviršius yra neigiamai įkrautas. Dėl šios elektrostatinės sąveikos chromoforas jungiasi prie ląstelės ir ją dažo.

Pagrindinių dažų pavyzdžiai yra metileno mėlynasis, krištolo violetinė, malachito žalia, bazinis fuscinas, safraninas.

Rūgštiniai dažikliai

Rūgštiniuose dažuose chromoforų grupė turi neigiamą elektrinį krūvį. Jie naudojami baltymams dažyti su teigiamai įkrautomis amino grupėmis. Rūgštinių dažų pavyzdžiai yra rūgšties fuscinas, rožinė Bengalija, Kongo raudona ir eozinas.

Diferencinis dažymas

Diferencialinis dažymo būdas susideda iš dviejų skirtingos spalvos ar intensyvumo dažų dažymo, kad mikroskopu būtų galima atskirti skirtingus mikroorganizmus. „Gram“ dėmė ir atsparumo rūgštiniam alkoholiui dėmė yra bakteriologijoje dažniausiai naudojamos diferencinės dėmės.

„Gram“ dėmė naudojama kaip išankstinis bandymas, siekiant sužinoti formą, dydį, ląstelių grupavimą, taip pat ląstelės sienos tipą. Naudojant „Gram“ dėmių testą, ląstelių sienelių bakterijos skirstomos į gramneigiamas ir gramneigiamas bakterijas.

Neigiamas dažymas

Taikant šį metodą, naudojami cheminiai dažikliai, kurie ne prasiskverbia pro ląstelės vidų, bet sudaro terpę, kurioje yra mikroorganizmai, kaip juodą foną.

Taikant neigiamą dažymo metodą, tepinėlis atliekamas su lašeliu indiško rašalo arba nigrosino suspensijos, kuri, leidus džiovinti kambario temperatūroje, sudaro nepermatomą plėvelę į šviesos praėjimą. Tokiu būdu mikroorganizmai iškyla kaip ryškios formos tamsiame fone.

Paruošimas

A. tepinėlis

1.- Labai gerai nuplaukite skaidres, nusausinkite sugeriamuoju popieriumi ir užklijuokite etiketes. Etiketėje turi būti nurodytas preparato turinys, data ir jį perdirbusio asmens vardas.

2.- Švieskite žiebtuvėlį ir sterilizuokite skiepijimo kilpą liepsnoje iki ryškiai raudonos.

3.- Leiskite rankenai atvėsti.

4.- Paimkite bakterijų kultūros mėgintuvėlį, nuimkite dangtelį ir greitai praeikite vamzdelio burną šalia degiklio liepsnos (liepsnos).

5.- Inokuliacijos kilpą įkiškite į mėgintuvėlį, kuriame yra bakterijų kultūra, ir paimkite mėginį.

6.- Jei kultūra yra skystoje terpėje, mėginį, paimtą rankena, įdėkite į stiklelio vidurį ir atsargiai paskleiskite maždaug 2 cm skersmens apskritimu.

7.- Sterilizuokite pasėjimo kilpą.

8.- Leiskite tepiniui išdžiūti ore.

9.- Pakartokite 3–8 veiksmus tris kartus.

10.- Jei kultūra yra kietoje terpėje, ant stiklelio prieš tai reikia įlašinti distiliuoto vandens lašą. Tai daroma norint sumaišyti nedidelį kultūros mėginį, paimtą su pasėjimo kilpa, kaip nurodyta 2–5 žingsniuose (aseptinės sąlygos).

11.- Skieskite praskiestą mėginį su vandens lašeliu ant stiklelio ir pakartokite tris kartus.

B. Fiksacija

1.- Įpilkite du lašus metanolio arba absoliutaus etanolio į sausus tepinėlius - iš kultūrų skystoje terpėje.

2.- Leiskite orui išdžiūti nuo žiebtuvėlio.

3.- Jei tepinėlis gaunamas iš kietos terpės kultūros, sausas tepinėlis fiksuojamas karščiu, 2–3 kartus greitai perduodant per šilčiausią lengvesnės liepsnos dalį.

4.- Palieskite apatinę tepinėlio dalį kairės rankos nugaros dalimi (dešiniarankiams; kitaip naudokite dešinę ranką) ir patikrinkite, ar šalta.

C. Paprastas dažymas

1.- Įpilkite 2 lašus pasirinktos dėmės į tepinėlį ir palikite veikti tiek laiko, kiek reikalaujama specialiuose kiekvienos dėmės protokoluose (paprastai nuo 1 iki 5 minučių).

2.- Kai kurioms dėmėms suaktyvinti reikalinga šiluma, tokiu atveju turite būti labai atsargūs, šildydami stiklelį lengvesnėje liepsnoje (elkitės su pincetu ir venkite virimo). Perkaitimas tepinėlio gali sunaikinti stebimas ląsteles.

3.- Pašalinkite dažiklio perteklių plaudami distiliuotu vandeniu iš picetės. Nuimkite plovimo vandenį, švelniai bakstelėdami stiklelį ant jo krašto, palenktą ant darbo stalo.

4.- Leiskite orui išdžiūti.

5.- Priklausomai nuo stebėjimo tipo, šiame etape naudojamas arba nenaudojamas dangtelis. Dangtelis apsaugo ir išsaugo tepinėlį. Jei šiame etape stebimas aliejaus panardinimas, dangteliai nenaudojami, tačiau tepinėlio negalima išsaugoti.

D. Galutinis tepinėlio išsaugojimas

1.- Tepinėlis iš eilės ne mažiau kaip 5 minutes panardinamas į kiekvieną iš žemiau nurodytų tirpalų. Šių „vonių“ tikslas yra visiškai dehidratuoti tepinėlį. Kiekvienas reagentas turi būti kruopščiai nusausintas prieš įpilant tepinėlio į kitą vonią.

Dehidratuojančių vonių tvarka yra tokia:

1. 70% etanolis
2. 95% etanolis
3. Grynas acetonas
4. Acetono-ksilolio 1: 1 mišinys
5. Ksilolis

Tada leiskite išdžiūti.

2.- Uždėkite dangtelio dangtelį, geriau 22 × 22 mm, naudodami „Canada“ balzamą ar kitą tvirtinimo medžiagą.

Nuorodos

1. Briggs, G. (1965). Priežastiniai mikrobiologinių laboratorinių avarijų ir infekcijų veiksniai. JAV armijos biologinės laboratorijos. Fort Detrikas.
2. Cappucino, JG ir Welch, CT (2017). Mikrobiologija: laboratorijos vadovas. Pearsonas.
3. Holtas, JG redaktorius. (1977). Trumpesnis Bergey‘s determinantinės bakteriologijos vadovas. 8 ^-asis Baltimorė: „The Williams and Wilkins Co.“
4. Johnsonas, TR ir Case; CL (2018). Laboratoriniai mikrobiologijos eksperimentai. Pearsonas.
5. Tille, P. (2017). Diagnostinė mikrobiologija. 14 ^-oji Sent Luisas, JAV: „Elsiever, Inc.“