STANDARTINIS AGARO RUTULIUKAS: PAGRINDIMAS, PARUOŠIMAS IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Standartas skaičius agaras yra kietas, neselektyvūs kultūros terpė, skirta už aerobikos mikrobų apkrovos metu mėginiuose tarp kitų maisto produktų geriamojo vandens, nuotekų, pieno gėrimų, kiekybinio. Ši terpė dar vadinama PCA agaru dėl savo akronimo angliškame Plate Count Agar. Jį 1953 m. Sukūrė Buchbinderis, Barisas ir Goldsteinas.

Standartinę agaro terpę sudaro mielių ekstraktas, tripteinas, gliukozė, agaras ir distiliuotas vanduo. Šioje kompozicijoje yra pagrindinių maistinių elementų, kurie leidžia sukurti esamą aerobinę mikrobų apkrovą, nėra reiklūs.

Dešimtainiai praskiedimai CFU skaičiavimui standartiniame agare. Šaltinis: Quentin Geissmann

Kadangi terpėje nėra inhibitorių, bakterijos gali augti be jokių apribojimų, todėl jos yra idealios bendram kolonijų skaičiavimui. Tačiau plokštelių kiekybinio įvertinimo metodu bus aptiktos ne visos esančios bakterijos, o tik tos, kurios gali augti aplinkos sąlygomis, kurioms taikomas standartinis sėklos skaičiavimo agaras.

Šia prasme plokštelių kiekybinio įvertinimo metodu paprastai siekiama nustatyti aerobinio mezofilinio tipo bakterijų kiekį, tai yra bakterijų, kurios išsivysto 25–40 ° C temperatūroje, o optimali augimo temperatūra yra 37 ° C. .

Ši bakterijų grupė yra labai svarbi, nes joje randama dauguma žmogui patogeninių bakterijų.

Reikėtų pažymėti, kad kartais gali būti įdomu išmatuoti psichofilinių bakterijų kiekį maiste. Šios bakterijos yra tos, kurios auga žemoje temperatūroje (<20 ° C) ir yra atsakingos už tai, kad maistas greičiau suirtų, net šaldant.

Taip pat termofilinės bakterijos, kurios vystosi nuo 50 ° C iki 80 ° C ar daugiau, gali būti svarbios tam tikrose maisto rūšyse, tokiose kaip konservai.

Mikrobų kiekybinis nustatymas išreiškiamas kolonijas sudarančiais vienetais (CFU) vienam gramui arba mililitre mėginio.

Pagrindas

Įprasta skaičiavimo terpė yra sukurta tam, kad būtų galima sėkmingai augti nerūpestingoms aerobinėms bakterijoms, nes mielių ekstraktas, tripteinas ir gliukozė suteikia būtinas maisto medžiagas geram mikrobų augimui.

Kita vertus, terpė yra šviesios spalvos ir skaidrios išvaizdos, todėl ji yra ideali kolonijų, sukurtų giliosios sėjos metodu (įpilti į lėkštę), vizualizacijai.

Taip pat įmanoma suskaičiuoti kolonijas naudojant Drigalski mentelės paviršiaus sėjimo metodą.

Kai mikrobų apkrova yra didelė, tiriamąjį mėginį reikia skaičiuoti dešimtainiais, kad būtų galima suskaičiuoti KSV.

Reikėtų pažymėti, kad šią terpę rekomenduoja aerobinių mezofilų skaičius Amerikos visuomenės sveikatos asociacijoje (APHA).

Paruošimas

Pasveriama 23,5 g dehidratuotos terpės ir ištirpinama litre distiliuoto vandens. Kad mišinys visiškai ištirptų, jį reikia kaitinti dažnai maišant, kol jis užvirs. Tolesni veiksmai priklauso nuo naudojamos sėjos technikos.

Skirta plokštelės technikai

Paskirstykite į mėgintuvėlius išpilant 12–15 ml. Vėliau sterilizuokite autoklave 121 ° C temperatūroje 15 minučių. Leiskite sukietėti vertikaliai bloko pavidalu. Iki naudojimo laikykite šaldytuve.

Kai ketinate naudoti, ištirpinkite kištuką. Kol tirpalas paruošiamas, laikykite jį 44–47 ° C vandens vonioje.

Paviršiaus sėjai

Sterilizuokite terpę autoklave 121 ° C temperatūroje, po to 20 ml paskirstykite į sterilius Petri lėkšteles. Leiskite sukietėti, apverskite ir laikykite šaldytuve iki naudojimo.

Prieš naudojimą atjunkite plokšteles. Terpės pH turėtų būti 7,0 ± 0,2.

Naudokite

Standartinis agaro agaras naudojamas aerobiniam mezofilinių skaičiavimų metodui atliekant vandens ir maisto mikrobiologinę analizę. Aerobinių mezofilų skaičius yra būtinas, nes tai lemia tiriamo mėginio sanitarinę kokybę.

Taikant šią metodiką (naudojant šią terpę) galima makroskopiškai vizualizuoti atskirtas kolonijas jų kiekybiniam įvertinimui.

Plokštelių išpylimo technika (sėjimo gylis)

-Procesas

Techniką sudaro šios dalys:

1) Homogenizuokite mėginį, kad pasiskirstytų esančios bakterijos.

2) Pradinė suspensija gaminama steriliame buteliuke ar maišelyje, atsižvelgiant į 10 g arba 10 ml mėginio santykį 90 ml skiediklio (10 ^-1 ).

3) Nuo pradinės suspensijos, atsižvelgiant į mėginio tipą, atliekamas atitinkamas dešimtainis skiedimas. Pvz .: (10 ^-2 , 10 ^-3 , 10 ^-4 ). Skiedžiami peptono vandeniu arba fosfato buferiu.

Norėdami tai padaryti, paimkite 1 ml pradinės suspensijos ir įpilkite į 9 ml skiediklio, jei reikia, tęskite praskiedimą, dabar imdami 1 ml 10 ^-2 skiedimo ir pan.

4) Paimkite 1 ml kiekvieno praskiedimo ir supilkite į tuščius sterilius Petri lėkšteles.

5) Į kiekvieną plokštelę įpilkite 12–15 ml etaloninio skaičiavimo agaro, anksčiau ištirpinto ir nusistovėjusio 44–47 ° C temperatūroje.

6) Švelniai pasukite plokšteles, kad mėginys tolygiai pasiskirstytų agare ir leistų sukietėti.

7) Apverskite plokšteles ir inkubuokite aerobiozėje 24–48 valandas 37 ° C temperatūroje.

8) Pasibaigus laikui, plokštelės ištiriamos ir kolonijos suskaičiuojamos praskiedžiant, kas tai leidžia. Skaičiavimui pasirenkamos tos plokštelės, kuriose yra nuo 30 iki 300 CFU.

Skaičiuoti galima rankiniu būdu arba galite naudoti kolonijų skaitiklio įrangą.

1 ml mėginio leidžiamos vertės įvairiose šalyse gali skirtis priklausomai nuo taisyklių, kuriomis jos reglamentuojamos.

-UFC apskaičiavimas

Bendras skaičiavimas atliekamas pagal šią formulę:

Bendrojo CFU kiekybinio apskaičiavimo formulė. Šaltinis: Nacionalinė vaistų, maisto ir medicinos technologijų administracija (ANMAT). Maisto mikrobiologinė analizė, oficiali analizės metodika, indikatoriniai mikroorganizmai. 2014 m. 3 tomas. Galima rasti: anmat.gov.ar

Rezultatus išreikškite 1 arba 2 skaitmenimis, padaugindami iš atitinkamos bazės 10. Pavyzdys: jei rezultatas yra 16,545, jis suapvalinamas pagal trečiąjį skaičių iki 17 000 ir bus išreiškiamas taip: 1,7 x 10 ⁴ . Jei rezultatas būtų 16 436, suapvalinkite jį iki 16 000 ir išreikškite 1,6 x 10 ⁴ .

Paviršinio sėjimo technika

-Procesas

- Į standartinės skaičiavimo agaro lėkštelės vidurį įpilkite 0,1 ml tiesioginio mėginio, jei jis yra skystas, pradinė suspensija 10 ^-1 arba iš eilės skiedžiami 10 ^-2 , 10 ^{-3 ir} tt.

- Mėginį tolygiai paskirstykite „Drigalski“ mentele arba L formos stiklo lazdele ir leiskite pailsėti 10 minučių.

- Apverskite plokšteles ir inkubuokite aerobiniu būdu nuo 24 iki 48 valandų 37 ° C temperatūroje.

- Norėdami suskaičiuoti kolonijas, pasirinkite tas plokšteles, kurių intervalas yra nuo 20 iki 250 CFU.

-UFC apskaičiavimas

Skaičiavimui naudojamas praskiedimo koeficientas, kuris yra atvirkštinis. Skaičius suapvalinamas iki 2 reikšminių skaitmenų (suapvalinamas pagal trečiąjį skaitmenį) ir išreiškiamas 10 bazės galia. Pvz., Jei pavyzdyje 224 KSV yra neskaičiuojamas (10 ^-1 ), pranešama 22 x 10 ¹ KSV. , bet jei šis skaičius buvo 225, pranešama 23 x 10 ¹ KSV.

Dabar, jei į 10 ^-3 skiedimą bus įskaičiuota 199 KSV , bus pranešta apie 20 x 10 ⁴ KSV, tačiau jei 153 KSV bus skaičiuojami tuo pačiu skiedimu, bus pranešta apie 15 x 10 ⁴ KSV.

QA

Standartinę kultūrinę terpę galima įvertinti naudojant žinomus sertifikuotus štamus, tokius kaip: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri.

Jei mitybinė terpė yra optimaliomis sąlygomis, visais atvejais tikimasi patenkinamo augimo, išskyrus L. fermentum, kurio derlius gali būti reguliarus.

Norint įvertinti kultūrinės terpės sterilumą, viena ar dvi kiekvienos paruoštos partijos plokštelės (be inokuliacijos) turėtų būti inkubuojamos 37 ° C temperatūroje aerobiozės metu 24 valandas. Praėjus šiam laikui, terpėje neturėtų būti stebimas augimas ar spalvos pasikeitimas.

Apribojimai

-Ar netirpinkite agaro daugiau nei vieną kartą.

- Paruošta terpė gali trukti iki 3 mėnesių, jei ji laikoma šaldytuve ir apsaugota nuo šviesos.

- Ši terpė netinka reikliems ar anaerobiniams mikroorganizmams.

Nuorodos

1. Nacionalinė vaistų, maisto ir medicinos technologijų administracija (ANMAT). Maisto mikrobiologinė analizė, oficiali analizės metodika, indikatoriniai mikroorganizmai. 2014 m. 3 tomas. Galima rasti: anmat.gov.ar
2. Laboratorijos „Difco Francisco Soria Melguizo“, SA Plokštės grafo agaras. 2009.Atsiejama: http://f-soria.es
3. „Conda Pronadisa“ laboratorijos. Standartinis agaro metodas (PCA) pagal APHA ir ISO 4833. Galima rasti: condalab.com
4. „Britannia“ laboratorijos. Agaro plokštelių skaičius. 2015.Atsiejama: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B ir Velázquez O. 2009. Maisto produktų mikrobiologinės analizės metodai. 2-asis leidimas UNAM Chemijos fakultetas. Meksika. Galima rasti: depa.fquim.unam