IMUNOFLUORESCENCIJA: PAGRINDIMAS, PROTOKOLAS IR PROGRAMOS - BIOLOGIJA - 2025

Imunofluorescencinis yra galinga technika imunodažymu naudojant antikūnus, kovalentiškai sujungtas su liuminescencinių molekulių nustatyti konkrečius tikslus ląstelių mėginių fiksuoto ant kieto pagrindo.

Šis metodas apima mikroskopinį stebėjimą, pasižymintį imunologiniu specifiškumu, leidžiantį pamatyti gyvas ar negyvas ląsteles, kuriose gali būti nedidelis antigenų kiekis. Jis plačiai naudojamas tiek tyrimų srityje, tiek klinikinėje įvairių patologijų diagnozėje.

Aktino gijų kardiomiocitų ląstelėse imuninis žymėjimas (šaltinis: Ps1415 per Wikimedia Commons)

Šis metodas, daugiausia kokybinis (su kai kuriais kiekybiniais variantais), ypač susijęs su mėginio vizualizavimu pagal fluoro signalo, kuris yra fluorescencinė molekulė, sujungta su antikūnu, ir kuri gali būti sužadinta tam tikro bangos ilgio, signalu. .

Ląstelių kontekste labai naudinga ištirti baltymų buvimą / nebuvimą ir tarpląstelinę vietą. Iš pradžių ši metodika buvo naudojama diagnozuojant virusus, tokius kaip gripas, ir vėliau daugelį kitų infekcinių ligų.

Tai labai jautri technika, todėl tinkama mikroskopijos įranga gali turėti labai gerą skiriamąją gebą. Jo stebėjimui reikia naudoti konfokalinius ar epifluorescencinius mikroskopus.

Nepaisant to, kad jis yra labai populiarus, jis gali sukelti tam tikrų svarbių problemų, susijusių su nespecifinės fluorescencijos gavimu, sukuriančia tam tikrą foninį „triukšmą“, o tai dažnai riboja tinkamą rezultatų skaitymą.

Pagrindas

Imunofluorescencija grindžiama antikūno ir antigeno sąveikos reakcijos biologinio reiškinio išnaudojimu. Tai konkrečiai susiję su šios reakcijos vizualizavimu ar aptikimu, jaudinančiomis fluorescencinėmis molekulėmis iki tam tikro bangos ilgio.

Antikūnas yra imunoglobulino baltymas, išskiriamas iš aktyvių B ląstelių, specialiai generuojamas prieš antigeną, prie kurio jis gali prisijungti turėdamas didelį afinitetą ir specifiškumą. Imunofluorescencija naudoja IgG imunoglobulinus, kurie tirpsta kraujo serume.

Antikūnai yra molekulės iki 950 kDa, sudarytos iš dviejų trumpų (lengvų) ir dviejų ilgų Y formos (sunkiųjų) peptidų grandinių. Tiek lengvoji, tiek sunkioji grandinės yra padalintos į du domenus: vienas kintamasis, galintis atpažinti antigeną, o kitas pastovus arba konservuotas, būdingas kiekvienai rūšiai.

Antigenai funkciškai yra apibrėžiami kaip molekulės, kurias gali atpažinti antikūnas ir kurios didžiąja dalimi yra baltymai. Kai gyvūnas yra veikiamas antigeno, aktyvuojami imuninės sistemos limfocitai, gaminantys specifinius antikūnus prieš jį ir veikiantys kaip gynybos sistema.

Antigenas, pavyzdžiui, baltymas, gali turėti daugiau nei vieną epitopą arba antikūno atpažinimo vietą, taigi gyvūno serumas, paveiktas antigeno, gali turėti polikloninius antikūnus prieš skirtingas to paties baltymo sritis.

Tada imunofluorescencija išnaudoja gyvūno sugebėjimą gaminti polikloninius antikūnus prieš specifinį antigeną, kad jį išgrynintų ir vėliau panaudotų to paties antigeno aptikimui kituose kontekstuose.

Tarp fluorescencinių dažų ar molekulių, dažniausiai naudojamų kai kuriems imunofluorescenciniams metodams, yra fluoresceino izotiocianatas (FITC), tetrametilmetamidotizocianatas-5 ir 6 (TRITC), daugelis cianinų, tokių kaip Cy2, Cy3, Cy5 ir Cy7, ir dažai, vadinami Alexa Fluor®. , pvz., „Alexa Fluor®448“.

Protokolas

Imunofluorescencijos protokolas skiriasi priklausomai nuo daugelio veiksnių, tačiau iš esmės jis apima linijinę žingsnių seką, susidedančią iš:

• Plokštelių ir ląstelių paruošimas
• Mėginių fiksavimas
• Permeabilizavimas
• Blokavimas
• Imuninis arba imuninis dažymas
• Surinkimas ir stebėjimas

-Paruošimas

Iš mėginių

Mėginių paruošimas priklausys nuo jų pobūdžio ir reikalingos patirties. Paprasčiausias atvejis, kai ląstelės naudojamos suspensijoje, bus paaiškintas žemiau.

Suspensijos ląstelės, tai yra skystoje kultūrinėje terpėje, pirmiausia turi būti atskirtos nuo jos centrifuguojant, o po to turi būti plaunamos buferiniu tirpalu arba izosmotiniu „buferiu“, kuris išsaugo jų vientisumą.

Paprastai naudojamas fosfatinio druskos tirpalo buferis, žinomas kaip PBS, kuriame ląstelės yra vėl suspenduojamos ir šis mišinys vėl centrifuguojamas, kad ląstelėse nebūtų kultūrinės terpės, kurioje gali būti trukdančių medžiagų.

Iš ašmenų

Objektyvai, naudojami mikroskopiniam stebėjimui, kur ląstelės vėliau bus fiksuojamos atitinkamam apdorojimui pasroviui, taip pat turi būti kruopščiai paruošti.

Jos yra padengtos arba „jautrinamos“ polilizino, sintetinio polimero, tirpalo, kuris veiks kaip „molekuliniai klijai“ tarp ląstelių ir kietojo atramos, dėka elektrostatinės sąveikos tarp teigiamų jų amino grupių ir ląstelių. neigiami baltymų, dengiančių ląsteles, krūviai.

Mėginių fiksavimas

Šis procesas susideda iš ląstelių, esančių ląstelėje, imobilizavimo, kad jų erdvinė vieta nepažeistų. Naudojamos molekulės turi sugebėti kirsti visų tipų ląstelių membranas ir sudaryti kovalentinius baltymus.

Plačiai naudojami formaldehidas ir paraformaldehidas, glutaraldehidas ir netgi metanolis, su kuriais ląstelių mėginiai tam tikrą laiką inkubuojami ir po to plaunami izosmotiniu buferiniu tirpalu.

Pritvirtinę ląsteles, jie ir toliau tvirtinami prie lapų, kurie anksčiau buvo įjautrinti poli-lizinu.

Permeabilizavimas

Priklausomai nuo to, kokio tipo tyrimas bus atliekamas, reikės permeabilizuoti tiriamas ląsteles ar ne. Jei norima žinoti tam tikro baltymo vietą, buvimą ar nebuvimą ląstelės paviršiuje, permeabilizuoti nereikės.

Kita vertus, jei norite sužinoti baltymo vietą ląstelėje, būtina prasiskverbti permeabilizaciją ir ją ims inkubuoti su Triton X-100 - plovikliu, gebančiu permeabiliuoti ląstelių membranas.

Blokavimas

Pagrindinis visų imunologinių metodų žingsnis yra blokavimas. Šiame procedūros etape blokavimą sudaro tai, kad įjautrinti lakštai uždengia visas vietas poli-lizino molekulėmis, prie kurių ląstelės neprilipo. Tai yra, jis užkerta kelią bet kokiai nespecifinei sąjungai.

Paprastai tirpalų blokavimui su galvijų serumo albuminu (BSA) PBS buferyje naudojami geriausi rezultatai, o geriausi rezultatai gaunami tuo ilgesnį inkubacijos laiką naudojant šį tirpalą. Po kiekvieno veiksmo, įskaitant blokavimą, reikia nuplauti likusį tirpalą.

Imuninis arba imuninis dažymas

Imuninio ar imuninio dažymo procedūra daugiausia priklausys nuo to, ar tai yra tiesioginė, ar netiesioginė imunofluorescencija (žr. Žemiau).

Jei tai yra pirminė ar tiesioginė imunofluorescencija, mėginiai bus inkubuojami su norimais antikūnais, kurie turi būti sujungti su fluorescenciniais dažais. Inkubacinę procedūrą sudaro antikūno praskiedimas tirpale, kuriame taip pat bus BSA, bet mažesne dalimi.

Kai tai yra antrinė ar netiesioginė imunofluorescencija, reikia atlikti dvi iš eilės inkubacijas. Pirmiausia su norimais antikūnais, o po to su antikūnais, kurie sugeba nustatyti pirminių imunoglobulinų pastovias sritis. Būtent šie antriniai antikūnai yra kovalentiškai sujungti su fluoroforais.

Metodas yra labai įvairiapusiškas, leidžiantis tuo pat metu žymėti daugiau nei vieną antigeną viename mėginyje, jei yra pirminiai antikūnai, sujungti su skirtingais fluoroforais, esant tiesioginei imunofluorescencijai.

Tuo pačiu metu ženklinant netiesiogine imunofluorescencija, būtina įsitikinti, kad kiekvienas pirminis antikūnas gaminamas skirtinguose gyvūnuose, taip pat, kad kiekvienas antrinis antikūnas būtų sujungtas su skirtingais fluoroforais.

Kaip ir blokavimas, inkubacija su antikūnais duoda geresnių rezultatų, tuo ilgesnis laikas. Po kiekvieno žingsnio būtina nuplauti antikūnų perteklių, kurie neprisirišo prie mėginių, o antrinę imunofluorescenciją reikia užblokuoti prieš dedant antrinį antikūną.

Tam tikrais būdais naudojamos kitos dėmės, nesusijusios su imuniniu dažymu, pavyzdžiui, branduolinės DNR dažymas DAPI fluoroforu.

Surinkimas ir stebėjimas

Inkubuojant su fluoroforais, bandiniai turi būti tamsoje. Stebėjimui po mikroskopu yra įprasta naudoti kai kurias medžiagas, kad būtų išsaugoti antikūnų sujungtų fluoroforų fluorescencija.

Tipai

Tiesioginės ir netiesioginės imunofluorescencijos grafinė santrauka (Šaltinis: Westhayl618 per Wikimedia Commons)

Tiesioginė arba pirminė imunofluorescencija

Tai susiję su antigenų nustatymu naudojant fluorescencinius antikūnus. Pagrindinis šio metodo pranašumas yra jo greitis, tačiau procese gali atsirasti daug nespecifinio surišimo atvejų, ypač tiriant žmogaus serumus, nes juose gausu labai nevienalyčių antikūnų.

Netiesioginė arba antrinė imunofluorescencija

Jis taip pat žinomas kaip „sumuštinio“ technika ir apima šios technologijos tobulinimą dviem etapais. Pirmiausia tai susiję su nefluoruojančio antikūno naudojimu ir jo prisijungimu prie dominančio antigeno.

Prieš nuolatinį šio pirmojo antikūno (kuris dabar bus naudojamas kaip antigenas) sritį, naudojamas antrasis antikūnas, galintis jį atpažinti, susietas su fluorescencine molekule.

Fluorescencinio signalo atsiradimas bus specifinio atpažinimo tarp pirmo ne fluorescencinio antikūno ir dominančio antigeno rezultatas; šio pirmojo antikūno buvimas sąlygoja antrojo antikūno buvimą, kuris yra paženklintas ir kurio dėka galima nustatyti antigeno buvimą ar nebuvimą.

Nepaisant to, kad tai yra daug daugiau laiko reikalaujanti technika nei tiesioginė imunofluorescencija (kadangi ji apima dar vieną inkubacijos etapą), ši technika neapima kiekvieno tiriamo antigeno fluorescencinio antikūno projektavimo, dėl kurio ekonomine prasme perspektyvesnis.

Be to, tai yra jautresnis būdas signalo amplifikacijai, nes daugiau nei vienas antrinis antikūnas gali jungtis prie nuolatinio pirminio antikūno srities, taip padidindamas fluorescencinio signalo intensyvumą.

Programos

Kaip jau buvo galima pastebėti anksčiau, imunofluorescencija yra ypač universali technika, kuri buvo naudojama įvairiais būdais mokslo ir klinikinėse srityse. Jis gali būti naudojamas atsakant į daugelio organizmų ekologinius, genetinius ir fiziologinius klausimus.

Tarp kitų klinikinių pritaikymų jis naudojamas tiesioginiam kai kurių dermatologinių ligų diagnozavimui, naudojant tiesioginę arba netiesioginę tiriamų pacientų epitelio audinio imunofluorescenciją.

Vienaląsčių organizmų, tokių kaip mielės, imunofluorescencijos metodai buvo naudojami intranuklearinėms ir citoplazminėms mikrotubulėms, aktinui ir susijusiems baltymams, 10 nm siūlams ir kitoms citoplazmos, membranos ir ląstelių sienelėms vizualizuoti.

Nuorodos

1. Abcam, imunocitochemijos ir imunofluorescencijos protokolas. Gauta iš abcam.com
2. Greph, C. (2012). Fluorescenciniai dažai. Gauta iš leica-microsystems.com
3. Milleris, DM, & Shakest, DC (1995). Imunofluorescencinė mikroskopija. „Metodai ląstelių biologijoje“ (48 tomas, p. 365–394). „Academic Press, Inc.“
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Imunofluorescenciniai metodai. Žurnalas „Investigative Dermatology“, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, ir Brian, K. (1991). Mielių imunofluorescenciniai metodai. „Enzimologijos metodai“ (194 tomas, p. 565–602). „Academic Press, Inc.“
6. Schaefferis, M., Orsi, E. V, ir Widelockas, D. (1964). Imunofluorescencijos taikymas visuomenės sveikatos virusologijoje. Bakteriologiniai atsiliepimai, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG ir Anderson, DM (1996). Imunofluorescencija fitoplanktono tyrimuose: taikymo būdai ir galimybės. J: Phycol. , 32, 1–16.