REKOMBINANTINĖ DNR: TECHNIKA, TAIKYMO BŪDAI IR PAGRINDAI - BIOLOGIJA - 2025

Rekombinantinės DNR (rDNR arba rDNR) yra dirbtinis nukleino rūgšties molekulė, sukurta laboratorijoje, integruojant du segmentus interesų organizacijoms. Dėl hibridinės savybės jis taip pat žinomas kaip chimerinė DNR. Tokio tipo DNR gamtoje nerasta.

Pagrindinė jo generavimo metodika apima: (a) tikslinės DNR atranką ir įdėjimą į kitą DNR fragmentą (paprastai bakterinę plazmidę); b) šios plazmidės įvedimas į bakteriją, c) bakterijų atranka naudojant antibiotikus ir galiausiai d) geno išraiška.

Šaltinis: pixabay.com

Technika pasinaudoja fermentų rinkiniu, leidžiančiu nukopijuoti ir įklijuoti specifinius DNR fragmentus pagal tyrėjo sprendimą.

Rekombinantinės technologijos tikslas daugeliu atvejų yra baltymo (žinomo kaip rekombinantinis baltymas) išraiška, kurio pageidauja molekulinis biologas būsimiems tyrimams, arba komercinės ir terapinės vertės baltymo, pavyzdžiui, žmogaus insulino, sukūrimas. pavyzdžiui.

Rekombinantinės DNR technologijos pagrindai ir jų panaudojimas genų inžinerijoje

Pagrindinė molekulinės biologijos dogma

Visoms žinomoms organinėms būtybėms būdingos kelios savybės. Vienas iš jų yra genetinės medžiagos pobūdis ir baltymų gamybos būdas - procesas, žinomas kaip centrinė molekulinės biologijos „dogma“.

Išskyrus keletą virusų, visi organizmai saugo genetinę informaciją DNR (dezoksiribonukleino rūgštis), labai kompaktiškai ir organizuotai surinktą ląstelės branduolyje.

Genų ekspresijai DNR molekulė perrašoma į pasiuntinio RNR, o pastaroji - į aminorūgščių, baltymų statybinių elementų, kalbą.

Kas yra rekombinantinė DNR?

Nuo 1970-ųjų iki 1980-ųjų molekuliniai biologai pradėjo naudoti procesus, kurie natūraliai vyksta ląstelės viduje, ir sugebėjo juos ekstrapoliuoti į laboratoriją.

Tokiu būdu gyvūninės kilmės geną (pavyzdžiui, stuburinį) būtų galima įterpti į bakterijos DNR segmentą; arba bakterijos DNR gali būti sujungta su virusine DNR. Taigi rekombinantinę DNR galime apibrėžti kaip molekulę, sudarytą iš dviejų skirtingų organizmų DNR.

Sukūrus šią hibridinę ar rekombinantinę molekulę, išreiškiamas dominantis genas. Žodžių išraiška norime paminėti baltymo virsmo procesą.

Restrikcijos fermentai ir ligatai: proceso raktas

Pagrindinis elementas kuriant rekombinantinę DNR technologiją buvo restrikcijos fermentų atradimas.

Tai yra baltymų molekulės, pasižyminčios gebėjimu suskaidyti DNR (nukleazę) į specifines sekas, veikiančias kaip „molekulinės žirklės“. Šių fermentų generuojami fragmentai vadinami restrikcijos fragmentais.

Minėti fermentai gali sudaryti simetrinius tikslinės sekos pjūvius (abiejose grandinėse tame pačiame aukštyje) arba asimetrinius pjūvius. Pagrindinis restrikcijos fermentų veikimo aspektas yra tas, kad suskaidžius grandines gaunamas „laisvas kraštas“, papildantis kitą kraštą, supjaustytą tuo pačiu fermentu.

Kai kurie pavyzdžiai yra ECOR 1 ir Sma 1. Šiuo metu yra žinoma ir parduodama daugiau kaip 200 restrikcijos fermentų rūšių.

Kad žirklės būtų naudingos, jas reikia pridėti prie klijų. Šis DNR (anksčiau apdoroto restrikcijos fermentais) sandarinimo veiksmas atliekamas ligatų būdu.

Technika: kaip laboratorijoje dirbtinai modifikuojamas organizmo DNR?

Žemiau aprašysime pagrindinius veiksmus, kurių reikalauja rekombinantinės DNR technologijos. Viską atlieka profesionalai molekulinės biologijos laboratorijoje.

Kas yra „klonas“?

Prieš tęsdami eksperimentinį protokolą, turime atkreipti dėmesį, kad molekulinėje biologijoje ir biotechnologijose terminas „klonas“ ir veiksmažodis „klonas“ yra plačiai vartojami. Tai gali sukelti painiavą.

Šiame kontekste turime omenyje ne viso organizmo klonavimą (kaip, pavyzdžiui, garsiosios avys Dolly), bet DNR gabalo, kuris gali būti genas, klonavimą. T. y. Gaminti daugybę sekų, genetiškai tapačių.

1. DNR išskyrimas ir gavimas

Pirmasis žingsnis yra nuspręsti, kurią seką norite naudoti. Tai visiškai priklauso nuo tyrėjo ir jo darbo tikslų. Tada ši DNR turi būti išskirta ir išgryninta. Metodai ir procedūros šiam tikslui pasiekti savo ruožtu priklauso nuo kūno ir audinių.

Paprastai paimamas audinio gabalas ir apdorojamas lizės buferiu proteinazės K (proteolitinio fermento) pavidalu, po to DNR ekstrahuojama. Vėliau genetinė medžiaga suskaidoma į mažus fragmentus.

2. Klonavimo vektorius

Atlikęs parengiamuosius veiksmus, tyrėjas siekia įterpti dominantį DNR segmentą į klonavimo vektorių. Nuo šiol šį DNR segmentą vadinsime balta DNR.

Plazmidės

Vienas iš dažniausiai naudojamų vektorių bakterinės kilmės plazmidėje. Plazmidė yra dviguba grandinė, žiedinė DNR molekulė, natūraliai randama bakterijose. Jie yra svetimi bakterijų chromosomai - tai yra, jie yra ekstrachromosominiai ir natūraliai randami šiuose prokariotuose.

Pagrindiniai vektoriaus elementai yra: (a) replikacijos pradžia, leidžianti sintetinti DNR; b) selekcinis agentas, leidžiantis identifikuoti organizmus, nešančius plazmidę su tiksline DNR, pavyzdžiui, atsparumą kai kuriems antibiotikams; ir (c) multiklonavimo vieta, kurioje randamos sekos, kurias atpažins restrikcijos fermentai.

Pirmoji sėkminga rekombinantinė DNR laboratorijoje buvo klonuota į pSC101 plazmidę iš E. coli bakterijos. Be replikacijos vietos, joje yra restrikcijos fermento EcoRI restrikcijos vieta ir atsparumo antibiotikams genas.

Tikslinė DNR įterpimas į plazmidę atliekamas naudojant ankstesniame skyriuje aprašytus restrikcijos fermentų ir ligatų molekulinius įrankius.

Likę vektorių tipai

Be plazmidžių, DNR gali būti įterpiama ir į kitus vektorius, tokius kaip bakteriofagas lambda, kosmidai, YAC (mielių dirbtinės chromosomos), BAC (bakterinės dirbtinės chromosomos) ir fagemidai.

3. Rekombinantinės DNR įvedimas

Gavus rekombinantinę DNR molekulę (plazmidėje ar kitame vektoriuje dominantį geną), ji įvedama į šeimininką arba organizmą-šeimininką, kuris gali būti bakterija.

Norint į svetimą DNR įnešti į bakteriją, naudojamas metodas, vadinamas bakterijų virsmu, kai organizmas yra apdorojamas dvivalenčiais katijonais, dėl kurių jis gali imti DNR.

Metodologiškai negalime garantuoti, kad 100% mūsų kultūros bakterijų efektyviai pasisavino mūsų rekombinantinę DNR molekulę. Čia pradeda žaisti plazmidės dalis, kurioje yra atsparumas antibiotikams.

Taigi bakterijos, paėmusios plazmidę, bus atsparios tam tikram antibiotikui. Norint juos parinkti, užteks uždėti minėtą antibiotiką ir paimti išgyvenusius.

4. „Derliaus“ baltymai

Pasirinkę bakterijas su savo rekombinantine DNR, mes pradedame naudoti šeimininko fermentinę techniką norimam baltyminiam produktui sukurti. Kai bakterijos dauginasi, plazmidė perduodama jų palikuonims, todėl dalijimosi metu ji neprarandama.

Ši procedūra naudoja bakterijas kaip tam tikrą baltymų „gamyklą“. Vėliau pamatysime, kad tai buvo labai aktuali procedūra kuriant veiksmingą medicininį gydymą.

Kai kultūra bus paruošta ir bakterijos pagamino didelius baltymų kiekius, ląstelė lizuojama arba sutrinka. Yra platus biocheminių metodų spektras, leidžiantis išgryninti baltymus pagal jų fizikines ir chemines savybes.

Kitame eksperimentiniame kontekste mes galbūt nesidomime baltymo generavimu, veikiau esame suinteresuoti gauti DNR seką per se. Jei taip būtų, plazmidė būtų naudojama kelioms dominančio fragmento kopijoms sukurti, kad pakaktų tikslinės DNR atitinkamiems eksperimentams atlikti.

Programos

Rekombinantinė DNR technologija atvėrė begalę galimybių molekulinės biologijos, biotechnologijų, medicinos ir kitose susijusiose srityse. Išskirtinės šios programos yra šios.

Genetinė analizė

Pirmoji paraiška yra tiesiogiai susijusi su molekulinės biologijos laboratorijomis. Rekombinantinė DNR technologija leidžia tyrėjams suprasti normalią genų funkciją, o generuoti baltymai gali būti naudojami tolesniems tyrimams.

Vaistų pramonė

Baltymai, pagaminti naudojant rekombinantinės DNR metodą, gali būti naudojami medicinoje. Du labai svarbūs šios srities pavyzdžiai yra žmogaus insulinas ir augimo hormonas, naudojami pacientams, kuriems šio baltymo trūksta.

Rekombinantinės DNR dėka šie baltymai gali būti generuojami nereikia ekstrahuoti jų iš kito žmogaus, o tai reiškia papildomas metodines komplikacijas ir kelia pavojų sveikatai. Tai padėjo pagerinti nesuskaičiuojamų pacientų gyvenimo kokybę.

Nuorodos

1. „Baca“, LEL ir „Álvarez“, CLC (2015). 2 biologija. Grupo redakcija „Patria“.
2. Cooperis, GM, Hausmanas, RE, ir Hausmanas, RE (2000). Ląstelė: molekulinis metodas (10 tomas). Vašingtonas, DC: ASM spauda.
3. Devlin, TM (2004). Biochemija: vadovėlis su klinikiniais pritaikymais. Aš atbuline eiga.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M., & Hou, H. (2016). Rekombinantinės DNR technologijos vaidmuo gerinant gyvenimą. Tarptautinis genomikos žurnalas, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP, & Mindan, P. (1996). Patologinė anatomija. Elsevier Ispanija.
6. „Tortora“, G. J., „Funke“, „BR“ ir „Case“, CL (2007). Įvadas į mikrobiologiją. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Žmogaus insulinas: pirmasis DNR technologijos vaistas. Amerikos žurnalas apie sveikatos sistemos farmaciją, 46 (11_suppl), S9-S11.