FOSFATO BUFERIS (VNT.): PAGRINDIMAS, PARUOŠIMAS IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Fosfatinis buferis, fosfatinio buferio druskų tirpalu arba BPS yra buferinis tirpalas izotoninis, kurio funkcija yra , kad išlaikyti pH ir osmosinį slėgį taip arti prie gamtinių biologinėje aplinkoje (fiziologinių). Santrumpa PBS reiškia fosfatiniu buferiniu tirpalu.

PH ir osmolariškumas yra du labai svarbūs aspektai, kuriuos reikia kontroliuoti tam tikruose laboratorijos protokoluose. Kalbant apie pH, labai svarbu jį kontroliuoti, ypač vykstant biocheminėms reakcijoms, nes šios reakcijos gali skirtis arba jų neatlikti, jei reagentų pH yra netinkamas.

PBS fosfatinis buferinis tirpalas esant dviem skirtingiems pH. Šaltinis: Pixinio.com

Tuo tarpu osmoliškumo kontrolė yra ypač svarbi dirbant su gyvomis ląstelėmis, nes ląstelių membranos plazmoje reaguoja pagal tirpių, kuriose jos randamos, koncentraciją.

Jei ląstelės bus perkeltos į hipertoninę terpę, jos bus dehidratuotos, nes vandens gradientas bus perkeltas į tą pusę, kur yra didesnė tirpių koncentracija. Kita vertus, jei ląstelės dedamos į hipotoninę terpę, ląstelės absorbuos skystį, kol lizuosis.

Štai kodėl PBS buferis naudojamas laboratoriniams protokolams, kuriems reikia palaikyti ląsteles in vitro, tokiu būdu ląstelės nebus pažeistos.

PBS yra sudarytas iš druskų, tokių kaip natrio chloridas, natrio fosfatas, kalio chloridas ir kalio fosfatas, derinio. PBS sudėtis gali skirtis priklausomai nuo protokolo.

Pagrindas

Iš esmės fosfato buferio funkcija yra palaikyti pastovų fiziologinį pH kartu su elektrolitų koncentracija, panašia į tą, kuri randama kūne.

Tokioje aplinkoje ląstelės sugeba išlikti stabilios, nes fiziologinės sąlygos yra kuo labiau modeliuojamos.

Jei reikia, prie pradinės PBS kompozicijos galima pridėti ir kitų junginių, pavyzdžiui, EDTA pridėjimas prie buferio yra naudingas raudoniesiems kraujo kūneliams plauti atliekant kryžminio nesuderinamumo testą.

EDTA neleidžia serume esančios komplemento C1 frakcijos suskaidyti ir lizuoti į raudonuosius kraujo kūnelius, ty išvengti klaidingų nesuderinamumo rezultatų. Be to, EDTA padeda atskirti ląsteles.

Paruošimas

Druskų, kurias reikia pasverti ruošiant PBS fosfatu buferinį druskos tirpalą, kiekis priklausys nuo paruošiamo kiekio:

-Fosfato buferiniu druskos pradiniu tirpalu (10x PBS)

Vienam litrui tirpalo:

Sverti:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Paruošimo technika

Sudėkite sunkias druskas į stiklinę, įpilkite pakankamai vandens (80%) ir maišydami maišykite ant magnetinės juostelės, kol druskos ištirps.

PBS paruošimas naudojant maišymo plokštelę su magnetine juosta. Šaltinis: vartotojas: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtruokite, kad pašalintumėte neištirpintas daleles. Naudokite filtrus su 0,45 µm poromis. Autoklavas ir aseptiniu būdu paskirstomas laminarinio srauto gaubte stikliniuose indeliuose su dangčiais.

10X tirpalas (koncentruotas) nederina pH. Koregavimas atliekamas praskiedus 1X PBS buferio koncentracijai (skiedimas santykiu 1:10).

- Buferinis druskos fosfato tirpalas (1X PBS)

1X PBS galima paruošti tiesiogiai, pasveriant atitinkamus kiekvienos druskos kiekius, arba jis gali būti paruoštas praskiedžiant pradinį tirpalą (1:10) steriliu distiliuotu vandeniu.

-Norėdami tiesiogiai paruošti litrą 1X PBS fosfato buferinio tirpalo, pasverkite:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

1.15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g KH ₂ HPO ₄

Paruošimo technika

Atlikite, kaip paaiškinta koncentruotame tirpale. Vėliau reikia sureguliuoti pH. Norėdami tai padaryti, išmatuokite pH ir, priklausomai nuo rezultato, naudokite rūgštį (HCl) arba bazę (NaOH), kad atitinkamai sumažintumėte arba padidintumėte pH, kol jis bus 7,4.

Rūgštis arba bazė pridedama po lašą, stebint tirpalo pH vertę, naudojant pH matuoklį. Filtruokite, autoklavuokite ir, jei reikia, aseptiškai paskirstykite į kūginius mėgintuvėlius ar stiklainius.

- Norėdami paruošti 1X PBS iš 10X pradinio tirpalo:

Praskieskite santykiu 1:10. Pavyzdžiui, norėdami paruošti 1 litrą 1X PBS, išmatuokite 100 ml pradinio tirpalo ir įpilkite 700 ml sterilaus distiliuoto vandens. Sureguliuokite pH ir pripilkite vandens iki 1000 ml.

Paruoštas PBS buferis yra bespalvis ir skaidrus.

Kasdienį PBS galima laikyti kambario temperatūroje, o likusią dalį - šaldytuve.

Sprendimai pH reguliavimui

HCl

100 ml 1 molinio HCL (druskos rūgšties).

Išmatuokite 91 ml distiliuoto vandens ir įpilkite į 250 ml talpos laboratorinę stiklinę.

Išmatuokite 8,62 ml koncentruoto HCl ir lėtai įpilkite į stiklinę, kurioje yra vandens (niekada nedarykite to atvirkščiai). Dirbdami su stipriomis rūgštimis (labai ėsdinančia medžiaga), imkitės tinkamų biologinio saugumo priemonių.

Sumaišykite 5 minutes, naudodami maišymo plokštelę su magnetine juostele stiklo viduje. Perkėlimas į 100 ml matavimo kolbą ir iki 100 ml su distiliuotu H ₂ O.

NaOH

100 ml NaOH (natrio hidroksido) 10 mol.

Išmatuokite 40 ml distiliuoto vandens ir įpilkite į 250 ml talpos laboratorinę stiklinę. Išmatuokite 40 g NaOH ir įpilkite į vandenį. Sumaišykite naudodami maišymo plokštelę su magnetine juosta stiklo viduje.

Supilkite į 100 ml matavimo kolbą ir praskieskite distiliuotu vandeniu iki žymės. Laikykitės biosaugos taisyklių, nes ši reakcija yra egzoterminė (ji išskiria energiją šilumos pavidalu).

Jei norite paruošti kitokį fosfatinio druskos tirpalo kiekį, galite rasti šią lentelę:

Šaltinis: „Virusinės ir žmogaus genomikos laboratorija, UASLP medicinos mokykla“

Programos

Pirmiausia jis naudojamas ląstelių biologijoje, imunologijoje, imunohistochemijoje, bakteriologijoje, virusologijoje ir tyrimų laboratorijose.

Tai idealiai tinka plauti ląsteles centrifuguojant (raudonuosius kraujo kūnelius), plaunant vienkartinius sluoksnius, atliekant spektroskopinius elipsometrijos metodus, nustatant bakterijų bioplėvelių kiekius, palaikant ląstelių kultūras virusams, kaip skalbimo tirpalą netiesioginės imunofluorescencijos metodui. ir monokloninių antikūnų apibūdinimo būdais.

Jis taip pat naudojamas ląstelėms ar audiniams pernešti, kaip skiediklis ląstelių skaičiavimui, ląstelių fermentų (tripsino) paruošimui, kaip skiediklis biomolekulių džiovinimo metodui, ir kitiems reagentams paruošti.

Kita vertus, Martin et al. 2006 m. Įrodė, kad PBS yra naudingas teismo medicinos laboratorijose, ypač atstatant spermą iš makšties tepinėlių arba atkuriant makšties ląsteles iš varpos tepinėlių. Tokiu būdu galima nustatyti, ar yra buvę lytinių santykių.

Apribojimai

- Kai kuriuose PBS buferiuose kaip konservantas yra medžiaga, vadinama natrio azidu. Šis junginys gali sukelti sprogstamąsias medžiagas, jei jis liečiasi su švinu ar variu. Dėl šios priežasties reikia atsargiai išleisti šį reagentą į kanalizaciją. Jei jis tokiu būdu išmetamas, reikia įpilti gausaus vandens, kad jis būtų kiek įmanoma praskiestas.

-Cinko neturėtų būti dedama į fosfato buferį, nes dėl jo druskos gali nusėsti.

-Wangen ir kt., 2018 m. Nustatė, kad PBS netinka pirminių ūminės mieloleukemijos (AML) ląstelių, išgautų iš periferinio kraujo, plovimui dėl to, kad daug ląstelių prarandamos lizės metu, labai sumažėjus medžiagai. baltymas.

Todėl jie nustatė, kad pirminės AML ląstelės neturėtų būti plaunamos PBS po laikymo skystame azote.

Nuorodos

1. Coll J. (1993). Diagnostikos metodai virusologijoje. Edas Diazas de Santosas. 360 psl
2. Rodríguez M, Ortiz T. Ląstelių kultūra. Vidutinio lygio keitimas. Sevilijos universiteto Normaliosios ir patologinės citologijos bei histologijos katedra. Galima rasti asmeniniame internetiniame puslapyje
3. Fosfato buferinio druskos tirpalo (PBS) paruošimas. (2008). Standartinės darbo procedūros (SOP) Žmogaus ir virusinės genomikos laboratorija UASLP Medicinos mokykla. Galima rasti: genomica.uaslp.mx
4. „Fosfato buferinis tirpalas“. Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2019 m. Balandžio 3 d., 19:36 UTC. 2019 m. Balandžio 13 d., 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Molekulinės biofizikos temos. Galima rasti adresu users.df.uba.ar
6. Rediar. Rankinis. PBS + EDTA. Galima rasti: felsan.com.ar
7. „Martin NC“, „Pirie AA“, „Ford LV“, „Callaghan CL“, „McTurk K“, Lucy D, „Scrimger DG“. Fosfato buferinio tirpalo panaudojimas ląstelėms ir spermatozoidams atstatyti iš tamponų. Sci teisingumas. 2006; 46 (3): 179–84. Galima rasti: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A ir kt. Konservavimo metodas ir fosfatais dengto druskos plovimas turi įtakos ūminės mieloidinės leukemijos proteomai. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Galima rasti: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Histochemijos teoriniai ir praktiniai pagrindai. Aukščiausioji mokslinių tyrimų taryba. Madridas. Galima rasti adresu books.google.co.ve