DAPI (4 ’, 6-DIAMIDINO-2-FENILINDOLIS): CHARAKTERISTIKOS, PAGRINDIMAS, PANAUDOJIMAS - CHEMIJA - 2025

DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) yra fluorescencinė objekto dažų tarnauja kaip tam persekiotoją, plačiai naudojama fluorescencijos mikroskopijos art arba tėkmės citometrijos, be kita ko. Jos skleidžiama fluorescencija yra ryškiai mėlyna, jos sužadinimas vyksta tarp 455–461 nm (UV šviesa).

DAPI dažai labai lengvai gali praeiti pro negyvų ląstelių membraną. Tai taip pat gali dažyti gyvų ląstelių branduolius, tačiau tokiu atveju jų koncentracija turi būti didesnė.

Fluorescencinių dažų DAPI cheminė struktūra. Šaltinis: Vaizdas: Failas: DAPI.svg yra šio failo vektorinė versija. Jis turėtų būti naudojamas vietoje šio rastraus vaizdo, kai jis nėra prastesnis / Richardo Wheelerio (Zephyris) Redaguotas vaizdas

Dažai gali pasiekti ląstelių DNR, kurioms būdingas ypatingas giminiškumas, labai aistringai jungiasi su azotinėmis bazėmis adeninu ir timinu. Dėl šios priežasties jis yra labai naudingas atliekant kai kuriuos molekulinės biologijos metodus.

Šis junginys priklauso indolinių dažų grupei ir įrodyta, kad jis turi didesnį jautrumą DNR nei etiidio bromidas ir propidžio jodidas, ypač agarozės geluose.

Šio fluorescencinio dažo naudojimas yra labai platus, nes jis yra naudingas: tiriant DNR pokyčius apoptoziniuose procesuose (ląstelių žūtis) ir todėl nustatant ląsteles šiame procese; DNR pėdsakų nuotraukai (DNR nuotraukų spausdinimui); ištirti bakterinį užterštumą; arba vizualizuoti branduolio segmentus.

Jis taip pat buvo naudojamas tiriant chromosomų juostas, nustatant Mycoplasmas sp DNR, atliekant DNR ir baltymų sąveiką, dažant ir skaičiuojant ląsteles imunofluorescencijos būdu ir netgi spalvinant subrendusius žiedadulkių grūdelius.

charakteristikos

DAPI yra jo cheminio pavadinimo santrumpa (4 ’, 6-diamidino-2-fenilindolis). Jo molekulinė formulė yra C ₁₆ H ₁₅ N _5. Jo molekulinė masė yra 350,3. Netoli UV šviesos diapazono (nuo 345 iki 358 nm) DAPI-DNR kompleksas sužadinamas maksimaliai, o didžiausia fluorescencijos emisija yra tarp 455–461 nm.

Šie dažai apibūdinami kaip geltoni milteliai, tačiau struktūros, pažymėtos šiuo fluoroforu, skleidžia ryškiai mėlyną šviesą.

Tai yra vandenyje tirpus junginys, tačiau norint paspartinti jo tirpimą, gali būti šiek tiek šilumos. Jis gali būti skiedžiamas PBS, bet ne tiesiogiai ištirpinamas jame.

Paruošus dažus, juos reikia laikyti tamsoje, ty apsaugoti nuo šviesos, 2–8 ° C temperatūroje (šaldytuve). Esant tokioms sąlygoms, dažai išlieka stabilūs ilgiau nei 3 savaites ar mėnesius.

Jei jis yra apsaugotas nuo šviesos, bet paliekamas kambario temperatūroje, jo stabilumas sumažėja iki 2 ar 3 savaičių, tačiau veikiamas tiesioginės šviesos jis blogėja labai greitai. Jei norite laikyti daug ilgiau, jį galima atšaldyti -20 ° C temperatūroje, paskirstant jį alikvotomis dalimis.

Pagrindas

Šis dažymas grindžiamas branduolinio prieštankio susidarymu pagrindiniuose molekulinės biologijos metoduose, tokiuose kaip srauto citometrija, fluorescencinė mikroskopija ir metafazės chromosomų ar tarpfazių branduolių dažymas.

Ši technika pagrįsta dideliu afinitetu dėl azotinių bazių (adenino ir timino), esančios genetinėje medžiagoje (DNR) mažame griovelyje. Nors citoplazmos lygmenyje jis palieka labai mažai fono.

Kai fluorescenciniai dažai jungiasi su adenino ir timino DNR sritimis, fluorescencija žymiai padidėja (20 kartų daugiau). Spalva, kurią ji skleidžia, yra ryškiai mėlyna. Pažymėtina, kad jungiantis prie GC (guanino ir citozino) bazių porų, fluorescencijos emisijos nėra.

Svarbu pažymėti, kad nors tai taip pat turi afinitetą RNR, tai nesukelia problemų, nes didžiausias šios molekulės energijos išsiskyrimo laipsnis yra kitoje bangos ilgyje (500 nm), skirtingai nei DNR, kuri tai daro esant 460 nm. Be to, prisijungus prie RNR fluorescencija padidėja tik 20%.

DAPI naudojamas daugiau negyvų (fiksuotų) ląstelių dažymui, nei gyvų ląstelių, nes pastarosioms dažyti reikia žymiai didesnės dažų koncentracijos, nes ląstelių membrana yra daug mažiau pralaidi DAPI, kai ji yra gyva.

DAPI dažai gali būti naudojami kartu su raudonais ir žaliais fluoroforais, kad būtų galima patirti įvairių spalvų įspūdį.

Naudokite

DAPI (4 ’, 6-diamidino-2-fenilindolis) yra puikus fluoroforas, todėl yra plačiai naudojamas įvairiuose metoduose ir įvairiems tikslams. Toliau paaiškinamas DAPI naudojimas pagrindiniuose metoduose.

Srauto citometrija

Tyrėjai Gohde, Schumann ir Zante 1978 m. Buvo pirmieji, kurie pasiūlė DAPI kaip fluoroforą srauto citometrijos technikoje, sulaukę didžiulio pasisekimo dėl didelio jautrumo DNR ir didelio intensyvumo fluorescencijos emisijoje.

DAPI naudojimas šioje technikoje leidžia ištirti ląstelių ciklą, nustatyti ląstelių kiekį ir nudažyti gyvas ir negyvas ląsteles.

Nors yra ir kitų dažiklių, tokių kaip etidžio bromidas, Hoechsto oksidas, oranžinis akridinas ir propidžio jodidas, DAPI yra vienas iš plačiausiai naudojamų, nes jis yra labiau fotoatylus nei anksčiau paminėti.

Šiam metodui reikia pritvirtinti ląsteles, tam gali būti naudojamas absoliutus etanolis arba 4% paraformaldehidas. Mėginys centrifuguojamas ir supernatantas išpilamas, vėliau ląstelės hidruojamos pridedant 5 ml PBS buferio 15 minučių.

Laikui bėgant, DAPI dėmę paruoškite dažymo buferiu (FOXP3 iš „BioLegend“), kurio koncentracija būtų 3 µM.

Centrifuguokite mėginį, išmeskite supernatantą ir 15 minučių kambario temperatūroje uždenkite 1 ml DAPI tirpalo.

Paimkite mėginį tinkamu lazeriu į srauto citometrą.

Srauto mikrofluorometrija

Kitas metodas, kuriame naudojamas DAPI, yra srauto mikro-fluorometrija kartu su kitu fluoroforu, vadinamu mithramicinu. Abu yra naudingi norint kiekybiškai įvertinti chloroplastų DNR, tačiau DAPI yra tinkamiausias T4 bakteriofago dalelių matavimui.

Hibridizacija

Ši technika iš esmės naudoja DNR zondus, pažymėtus fluorescenciniais dažais, kurie gali būti DAPI.

Mėginys turi būti termiškai apdorotas, kad denatūruotų dvigrandinę DNR ir paverčia ją dviem viengrandiais siūlais. Vėliau jis hibridizuojamas su DAPI pažymėtu denatūruotu DNR zondu, turinčiu dominančią seką.

Vėliau jis plaunamas siekiant pašalinti tai, kas nebuvo hibridizuota, DNR vizualizacijai naudojamas kontrastas. Fluorescencinis mikroskopas leidžia stebėti hibridizuotą zondą.

Šios technologijos tikslas yra aptikti chromosomų DNR specifines sekas, kad būtų galima diagnozuoti tam tikras ligas.

Šie citomolekuliniai metodai buvo labai naudingi nustatant detales tiriant kariotipus. Pvz., Jis parodė adenozino ir timino bazines poras turinčias sritis, vadinamas heterochromatinėmis sritimis arba DAPI juostomis.

Ši technika yra plačiai naudojama augalų ir gyvūnų chromosomų ir chromatino tyrimams, taip pat diagnozuojant prenatalines ir hematologines patologijas žmonėms.

Taikant šią metodą, rekomenduojama DAPI koncentracija 15 minučių yra 150 ng / ml.

Sumontuotas stiklines reikia laikyti apsaugotas nuo šviesos 2–8 ° C temperatūroje.

Imunofluorescencinis dažymas

Ląstelės fiksuojamos 4% paraformaldehidu. Jei reikia naudoti kitas dėmes, DAPI paliekamas kaip priešpriešinis paviršius ir ląstelės 15 minučių uždengiamos PBS tirpalu. Laikui bėgant, paruoškite DAPI tirpalą praskiedžiant PBS tokiu būdu, kad galutinė koncentracija būtų 300 µM.

Tada perteklinis PBS pašalinamas ir 5 minutes uždengiamas DAPI. Plauna kelis kartus. Objektinis stikliukas žiūrimas fluorescenciniu mikroskopu po atitinkamu filtru.

Saugos lapas

Šis junginys turi būti naudojamas atsargiai, nes tai yra mutageninių savybių turintis junginys. Aktyvuota anglis naudojama šiam junginiui pašalinti iš vandeninių tirpalų, kurie turi būti pašalinti.

Norint išvengti šio reagento avarijų, būtina naudoti pirštines, chalatus ir apsauginius akinius. Patekus ant odos ar gleivinės, vietą reikia nuplauti pakankamai vandens.

Niekada neturėtumėte pipetuoti šio reagento per burną, naudokite pipetę.

Neužterškite reagento mikrobinėmis medžiagomis, nes tai gali sukelti klaidingų rezultatų.

Neskieskite DAPI dėmės daugiau nei rekomenduojama, nes tai žymiai pablogins dėmės kokybę.

Saugokite reagentą nuo tiesioginės šviesos ir nelaikykite šiltai, nes tai sumažina fluorescenciją.

Nuorodos

1. „Brammer S“, „Toniazzo C“ ir „Poersch L.“ Corantes dažniausiai dalyvauja augalų citogenetikoje. Arq Inst. Biol., 2015, 82. Galima įsigyti: scielo.
2. „Impath“ laboratorijos. DAPI. Galima rasti šiuo adresu: menarinidiagnostics.com/
3. Cytocell laboratorijos. 2019. DAPI naudojimo instrukcijos. galima rasti svetainėje cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Upių ekologijos sampratos ir būdai. (2009). „Editorial Rubes“, Ispanija. Galima rasti adresu books.google.co.ve/
5. „Novaes R“, „Penitente A“, „Talvani A“, „Natali A“, „Neves C“, „Maldonado I.“. Fluorescencijos naudojimas modifikuoto dissektoriaus metodu, siekiant įvertinti miocitų skaičių širdies audinyje. Arkos liemenėlės. Kardiolis. 2012; 98 (3): 252–258. Galima įsigyti: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Fitoplazmų buvimas papajose (Carica papaya) Meksikoje. Žurnalas „Chapingo“. Sodininkystės ir daržininkystės serija, 2011; 17 (1), 47–50. Galima rasti: scielo.org.