„VOGES-PROSKAUER“ TESTAS: PAGRINDAS, PARUOŠIMAS IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

„ Voges-Proskauer“ testas yra biocheminis tyrimas, kuris padeda nustatyti bakterijas, priklausančias Enterobacteriaceae šeimai. Tai ypač naudinga diferencijuojant Escherichia coli padermes iš Klebsiella ir Enterobacter.

Tyrimas atliekamas skystoje terpėje, vadinamoje Metil Red - Voges Proskauer, geriau žinomoje sutrumpintai RM / VP. Ši terpė yra sudaryta iš buferinio polipeptono, gliukozės, dikalio fosfato ir distiliuoto vandens.

Metil Red-Voges Proskauer (RM / VP) komercinė terpė / VP testas buvo teigiamas ir neigiamas. Šaltinis: autoriaus nuotr. Magistrantūra. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, iš „Wikimedia Commons“

Dabartinė RM / VP terpė yra Clark and Lubs terpės modifikacija, kurioje iš pradžių buvo mažesnė peptonų ir gliukozės koncentracija. Taigi buvo pagaminta mažiau vandenilio jonų, reikalingų teigiamai Vogeso-Proskauerio reakcijai.

Testas grindžiamas mikroorganizmo sugebėjimu panaudoti gliukozę per butileno-glikolio kelią ir susidaryti neutralus galutinis produktas, vadinamas acetoinu, esant deguoniui ir šarminiam pH.

RM / VP terpėje galima ne tik atskleisti Voges-Proskauer testą, bet ir metilraudonojo testą.

Pagrindas

„Voges-Proskauer“ testo pagrindas

Terpėje esantys pluripeptonai suteikia būtinus mitybos reikalavimus bakterijų dauginimuisi. Savo ruožtu gliukozė yra pagrindinis junginys. Daugelis bakterijų turi galimybę metabolizuoti gliukozę ir sudaryti piruvo rūgštį.

Piruvavo rūgštis yra gliukozės metabolizmo vidurys, o iš ten kiekvienas mikroorganizmas gali eiti skirtingais keliais. Vieni sudarys mišriąsias rūgštis, tokias kaip pieno rūgštis, acto rūgštis, skruzdžių rūgštis ir gintaro rūgštis, kiti - neutraliais produktais, tokiais kaip 2,3-butanediolis.

Voges-Proskauer testas atskleidė mikroorganizmo sugebėjimą aerobinėmis sąlygomis sudaryti acetilmetilkarbinolį (acetoiną), tarpinį 2,3-butanediolio produktą.

Acetoinas redukuojamas ir sudaro 2,3-butandiolį, tačiau ši reakcija yra grįžtamoji, todėl, jei 2,3-butanediolis oksiduojamas, susidaro acetoinas. Todėl deguonis yra būtinas.

Dikalio fosfatas yra buferis, kurio buferinis tirpalas yra pH 6,9 ± 0,2.

Įrodymų atskleidimas ir aiškinimo pagrindas

Norint parodyti reakciją, reikia atlikti plėtrą naudojant du reagentus („Barrit“ reagentus), vadinamus „Voges A“ ir „Voges B“.

Voges A yra 5% α-naftolo tirpalas, o Voges B yra 40% kalio hidroksido preparatas. Jei kalio hidroksido nėra, jį galima pakeisti 40% natrio hidroksidu.

Α-Naftolis yra katalizatorius, padidinsiantis reakcijos spalvą, todėl testas bus jautresnis. Visada pirmiausia reikia įpilti α-naftolio, purtant mėgintuvėlį taip, kad terpė liestųsi su deguonimi. Tokiu būdu esamas acetoinas oksiduojamas į diacetilą, o 2,3-butandidiolis oksiduojamas, kad susidarytų acetoinas, pereinantis į diacetilą.

Taip α-naftolas prisijungs prie diacetilo, kuris savo ruožtu prisijungė prie guanidino branduolio, esančio aminorūgštyje argininas, pastarasis iš pluripeptonų.

Kalio arba natrio hidroksidas savo ruožtu yra atsakingas už CO ₂ absorbavimą ir reagavimą su peptonais. Dėl šios reakcijos susidaro rausvai rožinė spalva, gerai matoma po to, kai vamzdis labai gerai pakratytas.

Tinkamas diacetilo, peptono ir α-naftilo kiekis turi būti sumaišytas, kad spalva iškart atsirastų. Jei taip neatsitiks, mėgintuvėliui leidžiama pailsėti 15 minučių prieš aiškinant.

Testas paprastai būna teigiamas po 2–5 minučių, kai matoma silpnai rausva spalva. Jei paliekama stovėti nuo 30 min. Iki 1 val., Spalvos intensyvumas bus maksimalus (ryškiai raudona).

Neigiamas testas pasirodys, kai sultinys pagels. Po 1 valandos, jei bandymas bus neigiamas, dėl kalio hidroksido reakcijos į α-naftolį gali susiformuoti vario spalva.

Paruošimas

Vidutinis MR / VP

Pasveriama 17 g dehidratuotos terpės ir ištirpinama litre distiliuoto vandens. Leiskite pastovėti 5 minutes. Kaitinkite iki virimo, kad visiškai ištirptų. Įpilkite 3–4 ml mėgintuvėliuose ir 15 minučių sterilizuokite autoklave 121 ° C temperatūroje.

Dehidratuota terpė yra smėlio spalvos, o paruošta - šviesiai gintaro spalvos.

Galutinis terpės pH yra 6,9 ± 0,2.

„Voges“ reagentas

Pasveriama 5 g α-naftolo ir ištirpinama 50 ml absoliutaus etilo alkoholio. Tada toliau pilkite etilo alkoholį, kol jis pasieks 100 ml.

„Voges B“ reagentas

Pasverkite 40 g kalio hidroksido ir ištirpinkite 50 ml distiliuoto vandens stiklinėje. Stiklas turi būti dedamas į šalto vandens vonią, kad būtų galima kontroliuoti temperatūrą, nes tirpalui ištirpus, temperatūra smarkiai pakyla.

Tirpalui atvėsus, jis perpilamas į matavimo kolbą ir praskiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 100 ml.

„Voges-Proskauer“ bandymo procedūra

Norint atlikti „Voges-Proskauer“ testą, RM / VP sultinys iš grynos kultūros 18–24 valandas pasėjamas tiriamu mikroorganizmu.

Inokuliantas neturėtų būti labai tankus. Jis inkubuojamas 35–37 ° C temperatūroje 24–48 valandas, nors kartais reikia inkubuoti keletą dienų. „Cowan“ ir „Steel“ laikosi nuomonės, kad 5 dienos yra mažiausias inkubacijos laikas, būtinas norint nustatyti visas teigiamas Enterobacteriaceae šeimos Voges-Proskauer (VP) rūšis.

Testo kūrimas

Atskirkite 1 ml alikvotinę dalį į mėgintuvėlį ir ištirpinkite taip: įlašinkite 12 lašų (0,6 ml) „Voges A“ reagento ir 4 lašus (0,2 ml) „Voges B“. Sumaišykite, kad būtų aeracija, ir leiskite nusistovėti. 5–10 minučių prieš vertimą žodžiu. Tačiau jei testas vis dar neigiamas, leiskite jam sėdėti ir stebėkite mėgintuvėlį po 30 minučių iki 1 valandos.

Rausvai raudonos spalvos išvaizda rodo, kad Voges-Proskauer reakcija yra teigiama. Jei terpė išlieka geltona, reakcija yra neigiama.

Kūrėjų įtraukimas nurodyta tvarka ir kiekiu yra būtinas norint išvengti klaidingų negatyvų.

Naudokite

„Voges-Proskauer“ testas yra naudingas norint atskirti E. coli padermes, kurios yra VP neigiamos, iš Klebsiella, Enterobacter, Serratia genčių, be kitų, kurios yra VP teigiamos.

Šaltinis: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5-asis leidimas Redakcija Panamericana SA Argentina.

QA

Kontrolinės padermės, įskaitant Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium ir Enterobacter cloacae ATCC 13047, gali būti naudojamos išbandyti paruoštos terpės kokybę.

Laukiami rezultatai yra teigiamos Voges-Proskauer reakcijos tik K. pneumoniae ir E. cloacae atžvilgiu. Likusi dalis sukelia neigiamas reakcijas.

Nuorodos

1. „Britannia“ laboratorijos. MR-VP terpė. 2015.Atsiejama: www.britanialab.com
2. „Microkit“ laboratorijos. „M-Ident Voges Proskauer“. 2014. Galima rasti: http://www.medioscultivo.com
3. Macas Faddinas J. (2003). Biocheminiai tyrimai klinikinės svarbos bakterijoms nustatyti. 3-asis leidimas Redakcija Panamericana. Buenos Airės. Argentina.
4. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey ir Scotto mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Redakcija Panamericana SA Argentina.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5-asis leidimas Redakcija Panamericana SA Argentina.