SPORŲ DAŽYMAS: PAGRINDIMAS, BŪDAI IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Sporų dažymo yra metodika spalvos su pasipriešinimo struktūras, kurios sudaro tam tikrą bakterijų gentys, kai nepalankiomis sąlygomis; Šios struktūros atitinka tam tikrą išgyvenimo formą.

Yra daug genčių, kurios sudaro sporas; tačiau pagrindiniai yra Bacillus ir Clostridium. Šios gentys laikomos tinkamesnėmis, nes jos turi žmonėms patogeniškų rūšių.

Sporų dažymas Shaeffer - Fulton arba Wirtz-Conklin metodu. „Tambe“ (originalus įkėlėjas) iš „Wikimedia Commons“

Kiekviena bacila gali sukelti sporą. Preparato dažymo metu sporą galima rasti baciloje (endospora) arba už jos ribų (egzosporoje). Taikant įprastus bakterijų dažymo būdus, pavyzdžiui, „Gram“ dažymą, sporos lieka bespalvės.

Šiuo metu yra keletas dažymo metodikų, galinčių prasiskverbti per storą sporos struktūrą, kad ją dažytų. Šios metodikos yra labai įvairios; Tai apima Dornerio metodą, Möellerio dėmę ir Shaefferio - Fultono metodiką, dar žinomą kaip Wirtz-Conklin.

Iš visų paminėtų metodų Shaeffer-Fulton metodika yra plačiausiai naudojama įprastose laboratorijose. Jis pavadintas dviejų mikrobiologų, sukūrusių spalvą 1930 m., Vardu: Alicia Shaeffer ir MacDonald Fulton. Tačiau ši technika kartais pavadinama Wirtz-Conklin po dviejų 1900-ųjų bakteriologų.

Pagrindas

Sporos nedažomos įprastomis dėmėmis, nes jos turi labai storą sienelę. Sudėtinga sporų sudėtis neleidžia patekti daugumai dažiklių.

Jei sporos tiriamos iš išorės, stebimi šie sluoksniai: pirma, egzosporiumas yra ploniausias ir išorinis sluoksnis, kurį sudaro glikoproteinai.

Toliau eina odelė, užtikrinanti atsparumą aukštai temperatūrai, po kurios eina žievė, sudaryta iš peptidoglikano. Vėliau yra pagrindo siena, sauganti protoplastą.

Sporos yra dehidratuotos struktūros, turinčios 15% kalcio ir dipikolininės rūgšties. Todėl dauguma sporų dažymo būdų priklauso nuo šilumos taikymo, kad dažai galėtų prasiskverbti į storą struktūrą.

Kai sporos nusidažo, dažų pašalinti negalima. Naudojant „Shaeffer-Fulton“ metodą, malachito žalia patenka į vegetatyvines ląsteles ir, veikiant šilumai, prasiskverbia per endosporą, taip pat į egzosporą.

Plaunant vandeniu, dažai pašalinami iš vegetatyvinės ląstelės. Taip atsitinka todėl, kad malachito žalieji dažai yra šiek tiek baziniai, todėl silpnai jungiasi su vegetatyvine ląstele.

Vietoj to jis negali išeiti iš sporos, o galiausiai bacilos yra užkonservuotos safraninu. Šis pagrindas galioja likusiai technikai, kai atsitinka kažkas panašaus.

Sporų dažymo būdai

Sporoms dažyti reikia gauti gryną tiriamo įtartino padermės kultūrą.

Kultūra 24 valandas laikoma ekstremalioje temperatūroje, kad paskatintų mikroorganizmo sporuliaciją. Tam kultūra gali būti dedama į orkaitę 44 ° C temperatūroje arba į šaldytuvą (8 ° C) 24 arba 48 valandoms.

Jei paliekamas per ilgai minėtoje temperatūroje, bus pastebimos tik egzosporos, nes visos endosporos jau išėjo iš bacilos.

Pasibaigus laikui, ant švarios stiklelės reikia užlašinti kelis lašus sterili fiziologinio tirpalo. Tada paimama nedidelė kultūros dalis ir gerai išplatinama.

Po to jis paliekamas išdžiūti, fiksuojamas karštyje ir dažomas vienu iš toliau aprašytų būdų:

Dornerio technika

1- Mėgintuvėlyje paruoškite koncentruotos sporoto mikroorganizmo suspensiją distiliuotame vandenyje ir įpilkite tokio paties tūrio filtruoto Kinilo karbolo fuksino.

2–5 ir 10 minučių padėkite mėgintuvėlį į vonią su verdančiu vandeniu.

3- Ant švaraus stiklelio sumaišykite lašą ankstesnės suspensijos ir 10% vandeninio nigrosino tirpalo, užvirkite ir nufiltruokite.

4- Greitai paskleiskite ir nusausinkite švelniai kaitindami.

5 - Išnagrinėkite su 100X objektyvu (panardinimas).

Sporos nusidažo raudona spalva, o bakterijų ląstelės tamsiai pilkame fone atrodo beveik bespalvės.

Modifikuota Dornerio technika

1- Sporuoto mikroorganizmo suspensija paskleidžiama ant stiklelio ir fiksuojama šilumoje.

2- Mėginys uždengiamas filtravimo popieriaus juostele, į kurią pridedama karbola fuksino. Dažiklis kaitinamas 5–7 minutes Bunseno degiklio liepsna, kol susidaro garai. Tada popierius pašalinamas.

3 - Preparatas plaunamas vandeniu ir išdžiovinamas absorbciniu popieriumi.

4- Uždenkite tepinėlį plona 10% nigrosino plėvele, naudodami antrą skaidrę, kad paskleistumėte nigrosiną ar adatą.

Sporų ir bakterijų spalvos yra tokios pačios, kaip aprašyta ankstesniame pasaulyje.

„Shaeffer“ - „Fulton“ ar „Wirtz-Conklin“ technika

1- Ant stiklelio padarykite smulkią tepinėlį su sporuoto mikroorganizmo suspensija ir pritvirtinkite prie kaitros.

2- Uždenkite stiklelį 5% malachito žaliu vandeniniu tirpalu (ant stiklelio galite įdėti filtravimo popierių).

3 Šildykite virš „Bunsen“ degiklio liepsnos, kad išsiskirtų garai, ir pašalinkite liepsną. Kartokite veiksmą 6–10 minučių. Jei malachito žalias tirpalas procedūros metu išgaruoja per daug, galima pridėti daugiau.

4- Nuimkite filtrinį popierių (jei yra) ir nuplaukite vandeniu.

5- 30 sekundžių uždenkite stiklinę 0,5% vandeninio safranino (kai kuriuose metodų variantuose naudojamas 0,1% vandeninis safraninas ir palikite 3 minutes).

Taikant šią metodiką, sporos atrodo žalios, o bacilos - raudonos.

Trūkumas yra tas, kad jaunų kultūrų endosporos nedažomos, nes jos atrodo ypač skaidrios arba bespalvės. Norint to išvengti, rekomenduojama naudoti 48 valandų inkubacijos kultūras.

Möeller technika

1- 2 minutes uždenkite tepinėlį chloroformu.

2- Išmeskite chloroformą.

3 - 5 minutes uždenkite 5% chromo rūgštimi.

4- Nuplaukite distiliuotu vandeniu

5- lakštas yra padengtas karbolas-fuksino-fenikada ir yra veikiamas Bunseno degiklio liepsnos, kol išsiskiria garai; tada jis keletą akimirkų pašalinamas iš liepsnos. Operacija kartojama, kol baigsis 10 minučių.

6- Nuplaukite vandeniu.

7- Norėdami pašalinti spalvą, naudokite parūgštintą etanolį (druskos alkoholį). Jis paliekamas 20 ar 30 sekundžių.

8- Nuplaukite distiliuotu vandeniu.

9 - Kontrastingai padenkite lakštą 5 minutes metileno mėlynuoju.

10 - Nuplaukite distiliuotu vandeniu.

11 - Leiskite išdžiūti ir mėginys paimamas į mikroskopą.

Sporos atrodo raudonos, o bacilos - mėlynos. Svarbu neįkvėpti garų, nes jie yra toksiški ir ilgainiui gali būti kancerogeniniai.

Modifikuota „Möeller“ technika be šilumos

2007 m. Hayama ir jo bendradarbiai sukūrė Möeller technikos modifikaciją. Jie pašalino dažų kaitinimo etapą ir juos pakeitė įlašindami 2 lašus paviršiaus aktyviosios medžiagos Tergitol 7 į kiekvieną 10 ml karbobo fuksino-karbo tirpalo. Buvo gauti tie patys rezultatai.

Programos

Sporų spalva suteikia labai vertingos ir naudingos informacijos patogenui identifikuoti, nes jo buvimas, forma, vieta bacilyje ir galimybė deformuoti vegetatyvinę ląstelę, ar ne, yra duomenys, kurie gali vadovauti rūšiai įtrauktos į tam tikrą žanrą.

Šiame kontekste verta pasakyti, kad sporos gali būti apvalios arba ovalios, jos gali būti išdėstytos centre arba taip pat paracentralinėje, subminalinėje ar galinėje padėtyje.

Endosporų ir egzosporų formos ir padėties schema

Pavyzdžiai

- Clostridium difficile formuoja ovalią sporą galinėje padėtyje, kuri deformuoja bacilą.

- Clostridium tertium sporos yra ovalios, nedeformuoja bacilos ir yra gnybto lygyje.

- Clostridium tetani endospora yra galinė ir deformuoja bacilą, suteikdama būgnelio išvaizdą.

- Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy ir C. septicum sporos yra apvalios arba poodinio ovalo formos ir deformuoja bacilą.

- Clostridium sordelli endospora yra centrinėje padėtyje, su nedidelia deformacija.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. (5-asis leidimas). Argentina, „Panamericana SA“ redakcija

Nuorodos

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Pasiūlymas dėl supaprastintos metodikos dažyti bakterijų sporas netaikant šilumos - sėkmingas Moellerio metodo modifikavimas. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356–9.
2. Vikipedijos bendradarbiai. Moellero dėmė. Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2018 m. Lapkričio 3 d., 03:28 UTC. Galima rasti: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Mikrobiologinių metodų laboratorijos vadovas. Mikrobiologijos akademijos Pagrindinių mokslų katedra. Nacionalinis politechnikos institutas.
4. „Endospora“. Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2018 vasario 25, 10:20 UTC. 2019 m. Sausio 10 d., 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J ir bendradarbiai. (2006). Estremadūros autonominės bendruomenės darbo personalas. Konkrečios darbotvarkės IV tomas. Redakcija MAD. Sevilija – Ispanija, p. 211–212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), laboratorijos specialistas, Galisijos sveikatos tarnyba (SERGAS). Konkretaus dalyko darbotvarkės apimtis 2. Redakcinis MAD. Sevilija – Ispanija, p. 79–80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. (5-asis leidimas). Argentina, „Panamericana SA“ redakcija
8. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. 2009. „Bailey & Scott“ mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Argentina. „Panamericana SA“ redakcija