GRAMO DĖMĖ: PAGRINDIMAS, MEDŽIAGOS, TECHNIKA IR NAUDOJIMO BŪDAI - BIOLOGIJA - 2025

„ Gram“ dažymas yra paprasčiausias ir naudingiausias dažymo būdas diagnostinėje mikrobiologijoje. Šią techniką 1884 m. Sukūrė danų gydytojas Hansas Christianas Gramas, kuriam pagal ląstelės sienos sudėtį pavyko klasifikuoti bakterijas kaip gramteigiamas ir gramneigiamas.

1921 m. Huckeris padarė tam tikras modifikacijas, kad stabilizuotų reagentus ir pagerintų dažymo kokybę, todėl dėmė „Gram“ taip pat žinoma kaip „Gram-Hucker“.

Įvairūs tepalai, dažyti „Gram“ dėme. A. Gram teigiami kokciai. B. gramneigiami strypai. C. Grampozityvinės, polimorfonuklearinės ir vienbranduolės bacilos. D. mielės.

Taikant šią techniką taip pat galima stebėti mikroorganizmų formą, tai yra, jei jie, be kita ko, yra kokciai, bacilai, kokosbakterijos, pleomorfiniai, gijiniai. Taip pat kaip ir jo pasiskirstymas erdvėje: klasteryje, grandinėje, izoliuotai, poromis, tetraduose ir kt.

Įtarus bakterinę infekciją, dauguma gautų mėginių turėtų būti tepami ant stiklelio ir dažomi gramais, kad būtų galima atlikti mikroskopinį tyrimą.

„Gram“ ataskaita gydytojui padės išsiaiškinti, kokie mikroorganizmai gali būti infekcijos priežastis, prieš gaunant galutinį kultūros rezultatą.

Kai kuriais atvejais paciento gyvenimas yra labai susilpnėjęs, todėl gydytojams skubiai reikia Gram ataskaitos, kad būtų paskirtas empirinis gydymas, kol jie laukia mikroorganizmo identifikavimo.

Pvz., Jei gramas parodo, kad cerebrospinaliniame skystyje yra gramteigiamų kokcių, gydytojas vadovaujasi pradiniu gydymu antibiotikais, kurie pašalina šios rūšies bakterijas, pagal tam sudarytus protokolus.

Gavęs galutinį rezultatą su izoliuoto mikroorganizmo pavadinimu ir jo atitinkama antiograma, gydytojas įvertins, ar keisti terapiją, ar ne. Šis sprendimas bus priimtas atsižvelgiant į mikroorganizmo jautrumo antibiotikams, kuriuos jis gauna, ir paciento evoliucijos tyrimus.

Pagrindas

Tai yra technika, kurią sudaro 4 pagrindiniai žingsniai: dažymas, fiksavimas mordantu, spalvos pasikeitimas ir priešakinis dažymas. Todėl ši technika, be bakterijų dažymo, taip pat leidžia jas atskirti.

Krištolo violetinė spalva yra pirmasis naudojamas dažiklis. Jis turi afinitetą peptidoglikanui ir nudažys visas esančias bakterijas purpurine spalva, tada dedamas lugolis, kuris veikia kaip šarmas, tai yra, jis paskatins ląstelėje susidaryti netirpiems kristalų, violetinės ir jodo kompleksams - ribonukleariniams baltymams. .

Gram teigiamos bakterijos, turinčios storą peptidoglikano sienelę, sudaro daugiau kompleksų (krištolo violetinio jodo), todėl jos išlaiko dažus.

Be to, tai taip pat daro įtaką tam, kad gramneigiamų bakterijų sienelėje yra daugiau nesočiųjų rūgščių, kurios pasižymi dideliu giminingumu oksidatoriams (Lugol).

Tuo tarpu gramneigiamos bakterijos turi ploną peptidoglikano sluoksnį, dėl kurio bakterijos formuoja mažiau kompleksų nei gramneigiamos.

Tada eina spalvos pasikeitimo žingsnis, kai gramneigiamos ir gramneigiamos bakterijos elgiasi skirtingai.

Gramneigiamose bakterijose yra išorinė membrana, turtinga lipopolisaharidais, kuri yra jų ląstelių sienos dalis. Riebalai sunaikinami sąlytyje su acetono alkoholiu, todėl išorinė membrana tampa destabilizuota, išlaisvindama violetinį kristalą.

Tokiu būdu jis yra neutralizuojamas su safraninu arba baziniu fuksinu, kuris pasidaro raudonas.

Gram-teigiamų bakterijų atveju jos nenuslūgsta, nes baliklis veikia uždarant poras ir neleidžiant kristalų violetinės / jodo kompleksui ištekėti.

Todėl spalva su krištolo violetiniu išlieka stabili, o safraninui ar fuksinui nėra vietos. Štai kodėl šios bakterijos nusidažo mėlyna arba purpurine spalva.

medžiagos

„Gram“ dažymo rinkinį sudaro:

• Violetinė taurė
• Lugolis
• Acetono alkoholis
• Safraninas arba bazinis fuksinas

Dažų ir reagentų paruošimas

Kristalų violetinės spalvos tirpalas

Sprendimas:

Violetinis kristalas ------------- 2 gr

Etilo alkoholis 95% ----------- 20 cc

B sprendimas:

Amonio oksalatas ----------- 0,8 gr

Distiliuotas vanduo ------------- 80 cc

Norint galutinai paruošti krištolo violetinę medžiagą, A tirpalas turi būti praskiedžiamas distiliuotu vandeniu santykiu 1:10 ir sumaišomas su 4 dalimis B tirpalo. Mišinys prieš vartojimą laikomas 24 valandas. Filtruokite į gintaro spalvos butelį naudodami filtrinį popierių.

Kasdien sunaudojama suma perkeliama į butelį su gintaro lašintuvu.

Jodo-Lugolis

Pasverkite ir išmatuokite nurodytą kiekvieno junginio kiekį taip:

Jodo kristalai ------------- 1gr

Kalio jodidas ------------- 2gr

Distiliuotas vanduo ------------- 300 cc

Kalio jodidas pamažu ištirpsta vandenyje, po to pridedamas jodas. Tirpalas suplakamas į gintaro buteliuką.

Kasdien sunaudojama suma perkeliama į mažesnį gintaro buteliuką su lašintuvu.

Balinimas

95% etilo alkoholis -----------– 50 ml

Acetonas ------------------ 50 ml

Jis paruoštas lygiomis dalimis. Gerai uždenkite, nes jis linkęs išgaruoti.

Sudėkite į buteliuką su lašintuvu.

Šis preparatas keičia spalvą per trumpą laiką 5–10 sekundžių ir yra labiausiai rekomenduojamas.

Pradedantiesiems labiau patinka naudoti tik 95% etilo alkoholio, kai išblukimas yra lėtesnis nei 10–30 sek.

Labiau patyrę gali naudoti gryną acetoną, kur spalvos pasikeitimas įvyksta labai greitai - nuo 1 iki 5 sek.

Kontrastas

Safranino atsargų sprendimas

„Safranina“ -------------– 2,5 gr

Etilo alkoholis 95% --------– 100 kop

Pasvėrus nurodytą safranino kiekį, jis ištirpinamas 100 ml 95% etilo alkoholio.

Darbinis safranino tirpalas paruošiamas iš pradinio tirpalo.

Norėdami tai padaryti, išmatuokite 10 cc pradinio tirpalo, įpilkite 90 cc distiliuoto vandens, kad būtų 100 ml.

Kasdien sunaudojamą kiekį rekomenduojama perpilti į gintaro buteliuką su lašintuvu.

Mikroorganizmai, kurie silpnai dažo gramneigiamus su „Gram-Hucker“ dėme, pavyzdžiui, tam tikri anaerobai, Legionella sp, Campylobacter sp ir Brucella sp, gali būti žymiai geriau nudažomi, naudojant Kopeloff modifikuotą Gram Hucker dėmę, vadinama „Gram-Kopeloff“ dėme.

Ši technika keičia safranino dažus į bazinius fuksino. Atlikus šią modifikaciją galima efektyviai nudažyti minėtus mikroorganizmus.

Reagento laikymas

Paruošti dažikliai turėtų būti laikomi kambario temperatūroje.

Dažomo mėginio tepinėlio paruošimas

Mėginyje turi būti ne mažiau kaip 10 ⁵ mikroorganizmų, prieš tai tikėtina, kad mikroorganizmas bus stebimas tepinėlyje. Tepinėlius galima gaminti iš tiesioginio mėginio arba iš kultūrų kietoje ar skystoje terpėje.

Tepalai turėtų būti vienodi, gerai paskirstyti ir ne per stori, kad būtų geriau matomos esančios struktūros.

- Tiesioginių mėginių gramas

Gramas necentrifuguoto šlapimo

Šlapimas sumaišomas ir 10 μl dedama ant stiklelio. Bent vienos bakterijos / Dip lauko stebėjimas rodo, kad yra infekcija.

Tai reiškia, kad kultūra turės maždaug daugiau nei 100000 KSV / ml (10 ⁵ KSV / ml) šlapime, esantys 85% atvejų.

Šis metodas nėra naudingas, kai kolonijų skaičius mažesnis nei 100 000 CFU.

CSF gramas

CSF turėtų būti centrifuguojamas, supernatantas pašalinamas, o nuosėdos pasklinda ant stiklelio. Šis skystis normaliomis sąlygomis yra sterilus; bakterijų stebėjimas rodo infekciją.

Kvėpavimo takų mėginių gramas

Skreplių, bronchų ar bronchų alveolinis plovimas „Gram“, nors gali būti įvairių mikroorganizmų, visada padės diagnozuoti, be to, kad bus naudingas stebimų ląstelių tipas.

Skreplių atveju tepinėlis turėtų būti paruoštas pačiomis švelniausiomis mėginio dalimis.

Gramas išmatų

Nerekomenduojama atlikti gramus šio tipo mėginiams, nes jie neturi diagnostinės vertės.

-Gramų pasėlių

Jie gali būti daromi dviem būdais: vienas iš skystų kultūrų, kitas - iš kietų kultūrų.

Skystosios kultūros

Iš skystų kultūrų tai yra labai paprasta; Keletas drumsto sultinio kepsnių paimami po degikliu ir dedami ant švarios ir sausos plokštelės, sukamaisiais judesiais einant iš centro link periferijos, kad medžiaga būtų tolygiai paskirstyta.

Leiskite savaime išdžiūti ore. Išdžiūvusi medžiaga šiluma pritvirtinama prie lakšto. Norėdami tai padaryti, naudodamiesi pincetu, lakštas 3–4 kartus praleidžiamas per „Bunsen“ degiklio liepsną, stengiantis, kad medžiaga nesudegtų.

Lakštui leidžiama atvėsti ir jis dedamas ant dažymo tiltelio.

Kietos kultūros

Norėdami atlikti Gram dėmės tepinėlį iš kietos kultūros, atlikite šiuos veiksmus:

Prieš renkantis kolonijas, kurias reikia paimti, reikia paruošti stiklelį, įlašinus maždaug du lašus sterili fiziologinio druskos tirpalo.

Jei originalioje kultūrų plokštelėje yra keli skirtingi kolonijų tipai, gramavimui atlikti bus pasirinkta atskira kiekvienos kolonija. Kiekviena kolonija bus paimta su platinos kilpa, kad ištirptų druskos tirpale, anksčiau uždėtame ant stiklinės.

Apvalūs judesiai atliekami nuo centro periferijos link, kad būtų tolygiai paskirstyta kolonija ant stiklelio.

Leiskite savaime išdžiūti ore. Išdžiūvęs lakštas pritvirtinamas šiluma, kaip paaiškinta anksčiau (uždedant stiklelį žiebtuvėliu), stengiantis, kad medžiaga nesudegtų.

Ši procedūra turi būti atliekama su kiekviena skirtingo tipo kolonija. Ant popieriaus lapo reikia pažymėti, kas stebima, pavyzdžiui:

1 kolonija: Beta hemolizinė geltonoji kolonija: Klasteriuose buvo stebimi gramteigiami cocci

2 kolonija: Kreminės spalvos kolonija, be hemolizės: Buvo pastebėtos gramteigiamos coccobacilli.

Kiekviena skaidrė turi būti paženklinta, kad žinotume, ką stebime.

Technika

„Gram“ dažymo technika yra labai lengva atlikti ir yra palyginti nebrangi, todėl jos negalima praleisti mikrobiologijos laboratorijoje.

Tai daroma taip:

1. Užfiksuokite tepinėlį karščiu ir padėkite ant dažymo tiltelio.
2. 1 minutę skaidrę visiškai uždenkite krištolo violetiniu.
3. Nuplaukite vandeniu Neišdžiovinkite
4. Uždenkite lakštą lugolio tirpalu ir palikite veikti 1 minutę. Nuplaukite vandeniu Neišdžiovinkite.
5. Balinkite 5-10 sekundžių, švelniai pakratydami alkoholio acetonu. Arba pastatykite lakštą vertikalioje padėtyje ir nuleiskite dažiklio dažų lašus ant paviršiaus, kol pašalinsite neištirpusio violetinio stiklo perteklių. Neviršykite.
6. Nuplaukite vandeniu Neišdžiovinkite.
7. Pakeiskite stiklelį ant dažymo tiltelio ir 30 sekundžių uždenkite safraninu (Gram-Hucker) arba 1 min. Pagrindiniu fuksinu (Gram-Kopeloff).
8. Nuplaukite vandeniu
9. Leiskite savaiminiam orui išdžiūti vertikalioje padėtyje.

Išdžiūvus, įlašinkite 1 lašą panardinimo aliejaus ir stebėkite jį po 100X objektyvu šviesos mikroskopu.

Naudingumas

Šis metodas leidžia atskirti morfotintorinius daugumos bakterijų skirtumus.

Mielės taip pat išsiskiria šiuo dažymu. Jie imasi krištolo violetinės spalvos, tai yra, dažo gramneigiamai.

Kita vertus, galima atskirti sporos formavimo gramneigiamus strypus, kuriuose bacilose, kur susiformavo endospora, pastebima laisva erdvė, nors sporos nedažomos. Sporoms dažyti naudojami kiti metodai, tokie kaip Shaeffer-Fulton.

Reikėtų pažymėti, kad šis dažymas nėra naudojamas visų tipų bakterijoms dažyti, tai yra, yra atvejų, kai dažymas neveikia.

Šiuo atveju galima paminėti bakterijas, neturinčias ląstelės sienos. Pavyzdžiui: Mycoplasma gentis, sferoplastai, ureaplazmos, L formos ir protoplastai.

Jis taip pat labai blogai nudažo bakterijas, kurių sienelėse gausu mikoolių rūgščių, tokių kaip mikobakterijos, ir tarpląstelines bakterijas, tokias kaip chlamidijos ir Rickettsias.

Taip pat neveiksmingas dažant daugumą spirochetal bakterijų.

Yra tos pačios genties bakterijų, kurias galima pastebėti tame pačiame mėginyje kaip gramteigiamas ir gramneigiamas. Kai tai atsitinka, tai vadinama kintama gramų dėme, kurią gali sukelti maistinių medžiagų, temperatūros, pH ar elektrolitų koncentracijos pokyčiai.

Daznos klaidos

Perdėtas balinimas

Didesnis spalvos pasikeitimo žingsnis gali lemti klaidingų gramneigiamų mikroorganizmų stebėjimą.

Negalima ilgai laukti džiovinimo laiko, kad pridėtumėte panardinimo aliejų

Gram-teigiamos bakterijos gali nudažyti gramneigiamas (klaidingas gramneigiamas). Taip atsitinka todėl, kad senose kultūrose gali būti negyvų ar sugedusių bakterijų, ir tokiomis sąlygomis bakterijos neišlaiko krištolo violetinės.

Naudokite labai seną lugolio tirpalą:

Laikui bėgant, lugolis praranda savo savybes ir jo spalva išnyksta. Jei bus naudojamas jau išskaidytas reagentas, jis gerai neužfiksuos violetinės spalvos, todėl yra galimybė gauti vizualizaciją klaidingai gramneigiamų mikroorganizmų.

Mėlynas fonas

Tinkamai spalvos spalvos fonas bus raudonas. Mėlynas fonas rodo, kad spalvos pasikeitė nepakankamai.

Nuorodos

1. Ryanas KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medicininė mikrobiologija, 6-asis leidimas McGraw-Hill, Niujorkas, JAV
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. (5-asis leidimas). Argentina, „Panamericana SA“ redakcija
3. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. 2009. „Bailey & Scott“ mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Argentina. „Panamericana SA“ redakcija
4. Casas-Rincón G. 1994. Bendroji mikologija. 2-asis Venesuelos centrinio universiteto leidinys „Biblioteka“. Venesuelos Karakasas.
5. "Gramo dėmė". Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2018 spalio 4 d., 23:40 UTC. 2018 12 9, 17:11. Paimta iš es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Medicinos mikrobiologijos vadovas. 2-asis leidimas, Venesuela: Karabobo universiteto žiniasklaidos ir leidinių direktoratas.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Pagrindinės dėmės mikrobiologijos laboratorijoje. Neįgalumo tyrimai. 2014; 3 (1): 10-18.