ZIEHL-NEELSEN DĖMĖ: PAGRINDIMAS, REAGENTAI IR TECHNIKA - BIOLOGIJA - 2025

„ Ziehl-Neelsen “ dažymo technika mikroorganizmams atsparioms alkoholio rūgštims (ARA) nustatyti. Šios mikrobiologijos procedūros pavadinimas nurodo jos autorius: bakteriologą Franzą Ziehl ir patologą Friedrichą Neelseną.

Ši technika yra diferencinio dažymo tipas, kuris reiškia skirtingų dažų naudojimą siekiant sukurti kontrastą tarp struktūrų, kurias norite stebėti, atskirti ir vėliau atpažinti. Ziehl-Neelsen dėmė naudojama tam tikrų tipų mikroorganizmams identifikuoti.

Ziehl-Neelsen dėmė

Kai kurie iš šių organizmų yra mikobakterijos (pvz., Mycobacterium tuberculosis), nokarijos (pvz., Nocardia sp.) Ir kai kurie vienaląsčiai parazitai (pvz., Cryptosporidium parvum). Daugelį bakterijų galima klasifikuoti naudojant įprastą metodą, vadinamą „Gram“ dėme.

Tačiau kai kurioms bakterijų grupėms reikia kitų metodų, kad būtų galima jas identifikuoti. Tokioms technikoms kaip „Ziehl-Neelsen“ dažyti reikia dažų ir šilumos derinių, kad jie būtų pritvirtinti prie ląstelės sienos.

Tada prasideda balinimo procesas, leidžiantis gauti du rezultatus: atsparumą rūgščių ir alkoholių spalvos pokyčiams arba jų jautrumą.

Pagrindas

Šios dažymo technologijos pagrindimas grindžiamas šių mikroorganizmų ląstelių sienelės savybėmis. Sienelė sudaryta iš riebiųjų rūgščių, vadinamų miko rūgštimis; Jie pasižymi labai ilgomis grandinėmis.

Kai riebalų rūgštys turi labai ilgas struktūras, jos gali lengviau išlaikyti dažus. Kai kurias bakterijų gentis labai sunku nudažyti gramais, nes ląstelės sienelėje yra daug glikolio rūgščių.

Ziehl-Neelsen dažymui naudojamas fenolio junginys karbolas fuksinas, pagrindinė dėmė. Tai turi savybę sąveikauti su ląstelės sienelės riebalų rūgštimis, kurios yra vaškinės struktūros kambario temperatūroje.

Karbolas fuksino dažymas sustiprėja esant karščiui, nes vaškas tirpsta ir dažų molekulės greičiau juda į ląstelės sienelę.

Vėliau naudojama rūgštis pašalina ląsteles, kurios nebuvo dažytos, nes jų siena nebuvo pakankamai susijusi su dažais; todėl rūgšties baliklio stiprumas gali pašalinti rūgštinį dažiklį. Ląstelės, kurios priešinasi šiam spalvos pokyčiui, yra vadinamos greita rūgštimi.

Antrinis dažiklis

Po bandinio spalvos pašalinimo jis kontrastuojamas su kitu dažymu, vadinamu antriniu dažikliu. Paprastai naudojama metileno mėlyna arba malachito žalia.

Antriniai dažai dažo pagrindinę medžiagą ir dėl to sukuria kontrastą struktūroms, kurios buvo nudažytos pirmame etape. Tik pakitusios spalvos ląstelės sugeria antrąjį dažiklį (prieštankį) ir įgauna savo spalvą, o rūgštims greitai pasižyminčios ląstelės išlieka raudonos spalvos.

Ši procedūra dažnai naudojama nustatant Mycobacterium tuberculosis ir Mycobacterium leprae, kurios vadinamos rūgštimis greitai pasišalinančiomis bakterijomis.

Reagentai

Pirminis dažiklis

Naudojamas 0,3% karboolio fuksinas (filtruojamas). Šis dažiklis yra paruoštas iš alkoholių mišinio: fenolio etanolyje (90%) arba metanolio (95%) ir šiame mišinyje ištirpinama 3 gramai bazinio fuksino.

Balinimo tirpalas

Šiame etape gali būti naudojami 3% alkoholio rūgšties arba 25% sieros rūgšties tirpalai.

Antriniai dažai (priešiniai dažai)

Dažniausiai bandiniams kontrastuoti naudojami dažai yra 0,3% metileno mėlynos spalvos. Tačiau gali būti naudojami ir kiti, pavyzdžiui, 0,5% malachito žalia.

Technika

Greito rūgšties dažymo procedūra

Paruoškite bakterijų tepinėlį

Šis paruošimas atliekamas švarioje, sausoje skaidrėje, laikantis sterilumo atsargumo priemonių.

Tepinėlis džiovinamas

Leiskite tešlai išdžiūti kambario temperatūroje.

Šildykite mėginį

Mėginys turėtų būti šildomas, uždedant ugnį ant žemiau esančio stiklelio. Fiksavimas alkoholiu gali būti atliekamas tada, kai tepinėlis nebuvo paruoštas su skrepliais (apdorotas natrio hipochloritu, kad jis būtų balintas) ir jei jis nesiruošia dažyti iškart.

M. tuberculosis pašalinamas balikliu ir dažymo proceso metu. Neapdorotų skreplių šilumos fiksavimas neužmuš M. tuberculosis, o alkoholio fiksacija yra baktericidinė.

Uždenkite dėmę

Dėmė padengta karbolio fuksino tirpalu (pagrindine pagrindine dėme).

Šildykite dėmę

Tai daroma 5 minutes. Turėtumėte pastebėti garo išsiskyrimą (maždaug 60 ° C). Svarbu neperkaitinti ir vengti bandinio deginimo.

Šildydami dėmę, labai atsargiai reikia įkaitinti karbolio fuksiną, ypač jei dažymas atliekamas ant padėklo ar kito indo, kuriame buvo surinktos labai degios cheminės medžiagos iš ankstesnio dažymo.

Po stiklelius reikia uždegti tik nedidelę liepsną, naudojant anksčiau apšviestą tamponą, sudrėkintą keliais lašais rūgštaus alkoholio, metanolio ar 70% etanolio. Venkite didelio etanolyje pamirkyto tampono, nes tai yra gaisro pavojus.

Nuplaukite dėmę

Šis skalbimas turi būti atliekamas švariu vandeniu. Jei vandentiekio vanduo nėra švarus, geriau nuplaukite tepinėlį filtruotu ar distiliuotu vandeniu.

Užtepkite tepinėlį rūgščiu alkoholiu

Šio rūgštaus alkoholio kiekis turėtų būti 3%. Dengimas atliekamas 5 minutes arba tol, kol tepinėlis pakankamai spalvos, ty šviesiai rausvos spalvos.

Reikia atsižvelgti į tai, kad rūgštus alkoholis yra degus; todėl jis turi būti naudojamas labai atsargiai. Venkite arti užsidegimo šaltinių.

Nuplaukite dėmę

Skalbkite švariu, distiliuotu vandeniu.

Uždenkite tepinėlį dėme

Tai gali būti malachito žalios (0,5%) arba metileno mėlynos (0,3%) dėmės nuo 1 iki 2 minučių, naudojant ilgesnį laiką, jei tepinėlis yra plonas.

Nuplaukite dėmę

Vėl reikia naudoti švarų (distiliuotą) vandenį.

Nusausinti

Stalviršio užpakalinė dalis turi būti nuvalyta, o dėmė uždedama ant drenažo stovo, kad ji galėtų išdžiūti (džiovinimui nenaudokite absorbento popieriaus).

Ištirkite tepinėlį po mikroskopu

Turi būti naudojama 100X objektyvo ir panardinimo alyva. Sistemingai nuskaitykite tepinėlį ir užrašykite susijusius stebėjimus.

Interpretuokite rezultatus

Teoriškai mikroorganizmai, dažantys rausvą spalvą, yra laikomi teigiamais rūgšties kiekiu (AAR +).

Priešingai, jei mikroorganizmai nusidažo mėlyna arba žalia spalva, atsižvelgiant į dažus, naudojamus kaip priešinis dažas, jie laikomi neigiamais rūgšties kiekiais (AAR-).

Nuorodos

1. Apurba, S. ir Sandhya, B. (2016). Praktinės mikrobiologijos pagrindai (1-asis leidimas). „Jaypee Brothers“ medicinos leidykla.
2. Baumanas, R. (2014). Kūno sistemos mikrobiologija su ligomis (4-asis leidimas). „Pearson Education, Inc.“
3. Heritage, J., Evans, E. ir Killington, A. (1996). Įvadinė mikrobiologija (1-asis leidimas). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. ir Morton, V. (2006). Mikrobiologijos laboratorinis vadovas ir sąsiuvinis: taikymas paciento priežiūrai (11-asis leidimas). „McGraw-Hill“ išsilavinimas.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Mikrobiologijos vadovėlis (1-asis leidimas). BI leidiniai PVT.