KARBAMIDO SULTINYS: PAGRINDAS, PARUOŠIMAS IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Karbamido sultinys yra skystis kultūros terpė, naudojama aptikti ureazės fermento buvimą tam tikroje mikroorganizmų. Ureazė yra mikrobų fermentas, gaminamas konstituciškai, tai yra, jis sintetinamas nepriklausomai nuo to, ar jo substrato yra, ar ne.

Ureazės funkcija yra susijusi su organinių junginių skilimu. Ne visi mikroorganizmai yra pajėgūs sintetinti šį fermentą, todėl jo nustatymas laboratorijoje leidžia nustatyti tam tikras bakterijų padermes ir netgi atskirti tos pačios genties rūšis.

Neigiamas ir teigiamas karbamido testas. Šaltinis: autoriaus nuotr. Magistrantūra. Marielsa Gil.

Yra du karbamido tyrimo tipai: Stuartas ir Christensenas. Jie skiriasi savo sudėtimi ir jautrumu. Pirmasis yra ypatingas norint parodyti didelį ureazės kiekį, pagamintą iš Proteus genties rūšių.

Antrasis yra jautresnis ir gali aptikti nedidelį ureazės kiekį, kurį vėliau sukuria kitos bakterijų gentys, tokios kaip Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter ir Mycobacterium.

Stuarto karbamido sultinį sudaro karbamidas, natrio chloridas, dikalio fosfatas, monokalio fosfatas, mielių ekstraktas, fenolio raudonasis ir distiliuotas vanduo.

Tuo tarpu Christenseno karbamido sultinį arba agarą sudaro peptonai, natrio chloridas, monikalio fosfatas, gliukozė, karbamidas, fenolio raudonasis, distiliuotas vanduo ir agaro agaras. Pastaroji tik tuo atveju, jei tai kieta terpė.

Pagrindas

Fermentas ureazė hidrolizuoja karbamidą, sudarydamas anglies dioksidą, vandenį ir dvi amoniako molekules. Šie junginiai reaguoja sudarydami galutinį produktą, vadinamą amonio karbonatu.

Stuarto karbamido sultinys

Stuarto karbamido sultinys yra labiau buferinis, kai pH yra 6,8. Todėl mikroorganizmas turi sugebėti suformuoti didelius kiekius amoniako, kad fenolis būtų raudonas. PH turėtų pakilti virš 8.

Todėl Stuarto karbamido sultinys yra selektyvus Proteus rūšims, duoda teigiamų rezultatų per 24–48 valandas nuo inkubacijos, ir jis nėra efektyvus bakterijoms, kurios gamina mažą karbamido kiekį arba lėtai hidrolizuoja karbamidą.

Taip yra todėl, kad „Proteus“ rūšys gali naudoti karbamidą kaip azoto šaltinį. Kitoms ureazę gaminančioms bakterijoms reikia papildomo šaltinio.

Tačiau Pérez et al. (2002) nustatė, kad Stuarto karbamido sultinys buvo toks pat efektyvus kaip Christenseno karbamido agaras, nustatant ureazę Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon ir Saccharomyces genčių mielių kamienuose.

Tyrimo autoriai teigia, kad inkubuodami 24 ir 48 valandas, pasiekė 100% susitarimą su abiem žiniasklaidos priemonėmis (Stuartu ir Christensenu); išskyrus tuos atvejus, kai padermės, kurios sugebėjo paversti terpę stipria rausvos-fuksijos spalva, buvo laikomos teigiamomis.

Šis patikslinimas yra būtinas, nes Lodderis (1970) teigė, kad beveik visoms mielėms pavyksta Christensen karbamido agarą paversti blyškiai rožiniu. Taip yra dėl to, kad jie gali hidrolizuoti karbamidą minimaliais kiekiais, ir aminų susidarymas oksidaciniu dekarboksilinimo būdu aminorūgštims paviršiuje. Tai neturėtų būti suprantama kaip teigiama.

Christenseno karbamido agaras arba sultinys

Christenseno karbamido sultinys ar agaras yra mažiau buferiniai, nes jame galima aptikti nedidelius amoniako kiekius. Be to, ši terpė yra praturtinta peptonais ir gliukoze. Šie junginiai skatina augti kitus ureazę gaminančius mikroorganizmus, kurie neauga Stuarto sultinyje.

Christenseno karbamido testas taip pat suteikia spartesnius rezultatus, ypač „Proteus“ atveju. Gali duoti labai teigiamus rezultatus tik per 30 minučių kaip minimalų laiką ir iki 6 valandų kaip maksimalų laiką.

Likusiems ureazę gaminantiems mikroorganizmams terpės spalva šiek tiek pasikeičia po 6 valandų, o stipriai po 24, 48, 72 ir daugiau valandų, ir net kai kurios padermės gali sukelti silpną reakciją po 5 ar 6 dienų.

Abiejų žiniasklaidos priemonių (Stuarto ir Christenseno) aiškinimas

Iš pradžių terpė yra gelsvai oranžinės spalvos, o teigiama reakcija pavers terpę rausvai fuksijos spalva. Spalvos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas gaminamo amoniako kiekiui.

Neigiama reakcija paliks originalios spalvos terpę, išskyrus mieles, kurios Christensen karbamido agaro terpėje gali tapti šviesiai rausvos.

Paruošimas

Stuarto karbamido sultinys

Pasverkite reikiamus gramus pagal komercinės įmonės nurodymus. Geriausiai ištirpinkite steriliame distiliuotame vandenyje. Netirpinkite šilumos, nes karbamidas yra jautrus karščiui.

Membranos filtravimas naudojamas sterilizacijai. Tam naudojamas Millipore filtras, kurio poros yra 0,45 μm skersmens. Nenaudokite autoklavo. Kai tirpalas filtruojamas, jis paskirstomas į sterilius mėgintuvėlius. Norint gauti patikimus rezultatus, jis turėtų būti perpilamas iš mažiausiai 1,5 ml į didžiausią kiekį ir 3 ml.

Prieš naudojimą laikyti šaldytuve ir šiltai.

Jei filtravimo metodo nėra, terpė turėtų būti naudojama nedelsiant, kad būtų gauti patikimi rezultatai.

Kitas būdas paruošti Stuarto karbamido sultinį yra toks:

Kai kurie komerciniai namai parduoda karbamido tyrimui skirtą bazinę terpę, išskyrus karbamidą.

Pasveriamas komercinės įmonės nurodytas kiekis. Jis ištirpinamas distiliuotame vandenyje ir 15 minučių sterilizuojamas autoklave 121 ° C temperatūroje. Paliekama šiek tiek pailsėti ir, kai terpė šilta, įpilama 100 ml 20% paruošto karbamido tirpalo ir sterilizuojama filtruojant.

Jis paskirstomas steriliuose mėgintuvėliuose, kaip aprašyta anksčiau.

Christenseno karbamido agaras arba sultinys

- Karbamido tirpalo paruošimas

Pasverkite 29 g dehidratuoto karbamido ir ištirpinkite 100 ml distiliuoto vandens. Norėdami sterilizuoti, naudokite filtravimo metodą. Negalima autoklavo.

- karbamido agaras

Ištirpinkite 24 g dehidratuoto bazinio agaro 950 ml distiliuoto vandens. Sterilizuokite autoklave 121 ° C temperatūroje 15 minučių. Leiskite pailsėti, kol ji pasieks 50 ° C temperatūrą, ir aseptiškai įpilkite anksčiau paruošto karbamido.

Supilkite 4-5 ml į sterilius mėgintuvėlius ir pakreipkite iki vientisos masės. Turėtų būti ilgas fleitos snapas.

Ši terpė gali būti paruošta ir skystu pavidalu.

Programos

Karbamido tyrimas yra ypač efektyvus, norint atskirti Proteus gentį nuo kitų Enterobacteriaceae šeimos genčių, atsižvelgiant į greitą „Proteus“ reakciją.

Naudojant Christenseno kompoziciją, bandymas padeda atskirti tos pačios genties rūšis. Pavyzdžiui, S. haemolyticus ir S. warneri yra koaguliazės neigiami ir beta hemoliziniai stafilokokai, tačiau skiriasi tuo, kad S. haemolyticus yra karbamido neigiami, o S. warneri yra teigiami karbamido.

Kita vertus, McNulty sėkmingai panaudojo Christensen 2% karbamido sultinį, norėdamas ištirti Helicobacter pylori buvimą biopsijos mėginiuose, paimtuose iš skrandžio gleivinės (antralinės srities).

Apie H. pylori buvimą liudija teigiamas šlapalo testas. Rezultatų stebėjimo trukmė yra tiesiogiai proporcinga esančių mikroorganizmų kiekiui.

Kaip matyti, tai paprastas metodas diagnozuoti Helicobacter pylori skrandžio biopsijose.

Galiausiai šis testas taip pat naudingas norint atskirti rūšis nuo Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus ir Mycobacteria genčių.

Sėjamas šlapalo tyrimas

Norint optimizuoti rezultatus, būtina naudoti stiprų mikrobinį užkratą. Geriausia, kai bakterijų kolonijos imamos iš kraujo agaro, o mielės - iš Sabouraud agaro, su keliomis išimtimis. Inokuliantas emulsinamas skystoje terpėje.

Stuarto karbamido sultiniam inkubuokite 24–48 valandas 37 ° C temperatūroje, žinodami, kad „Proteus“ padermių ieškote tik tada, kai padermė yra bakterija. Mielėms jas galima inkubuoti 37 ° C arba kambario temperatūroje 24–48 inkubavimo valandas.

Christenseno karbamido sultinys inkubuojamas 37 ° C temperatūroje 24 valandas. Jei testas neigiamas, jį galima inkubuoti iki 6 dienų. Jei testas yra teigiamas prieš 6 valandas, tai rodo, kad tai yra Proteus genties kamienas.

Christenseno karbamido agaro atveju agaro kūgis yra stipriai pasėjamas, nepurškiant. Sultinys inkubuojamas ir aiškinamas vienodai.

QA

Kontrolės padermės, tokios kaip Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 ir Salmonella typhimurium, gali būti naudojamos terpei tirti. Pirmieji du turėtų duoti teigiamų rezultatų, o paskutiniai du - neigiamų.

Šaltinis: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5-asis leidimas Redakcija Panamericana SA Argentina.

Nuorodos

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Stuarto karbamido sultinio panaudojimas ureazės tyrimui kaip testas diagnozuojant mieles. Soc. Ven. Mikrobiolis. 2002; 22 (2): 136–140. Galima rasti: Scielo.org.
2. Macas Faddinas J. (2003). Biocheminiai tyrimai klinikinės svarbos bakterijoms nustatyti. 3-asis leidimas Redakcija Panamericana. Buenos Airės. Argentina.
3. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey ir Scotto mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Redakcija Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5-asis leidimas Redakcija Panamericana SA Argentina.
5. „Britannia“ laboratorijos. „Christensen Medium“ (karbamido agaro bazė) 2015.Atnaujinama: britanialab.com