ENDONUKLEAZĖS: FUNKCIJOS, TIPAI IR PAVYZDŽIAI - BIOLOGIJA - 2025

Kad endonukleazės yra fermentai, kurie pjauna fosfodiesterio obligacijas, esančias nukleotidų grandinės. Endonukleazių restrikcijos vietos yra labai įvairios. Kai kurie iš šių fermentų DNR (dezoksiribonukleorūgštis, mūsų genetinė medžiaga) išpjauna beveik bet kur, tai yra, jie nespecifiniai.

Priešingai, yra kita grupė endonukleazių, kurios yra labai specifiškos skilimo srityje ar seka. Ši fermentų grupė yra žinoma kaip restrikcijos fermentai, ir jie yra labai naudingi molekulinėje biologijoje. Šioje grupėje turime gerai žinomus fermentus Bam HI, Eco RI ir Alu I.

Endonukleazės išpjauna DNR iš vidaus.
Šaltinis: pixabay.com

Priešingai nei endonukleazės, yra ir kitas katalizinių baltymų tipas - egzonukleazės -, atsakingos už fosfodiesterinių ryšių nutraukimą grandinės pabaigoje.

Restrikcijos endonukleazės

Restrikcijos endonukleazės arba restrikcijos fermentai yra kataliziniai baltymai, atsakingi už fosfodiesterinių ryšių DNR grandinės viduje suskaidymą labai specifinėmis sekomis.

Šiuos fermentus galima įsigyti iš kelių biotechnologijų kompanijų, ir jų naudojimas yra beveik būtinas naudojant dabartinius manipuliavimo DNR metodus.

Restrikcinės endonukleazės yra įvardijamos naudojant pirmąsias binominio mokslinio organizmo, iš kurio jie kilo, pavadinimo raides, po kurių eina padermė (tai neprivaloma) ir baigiasi restrikcijos fermentų grupe, kuriai jie priklauso. Pavyzdžiui, „Bam HI“ ir „Eco RI“ yra plačiai naudojamos endonukleazės.

DNR sritis, kurią fermentas atpažįsta, vadinama restrikcijos vieta ir yra unikali kiekvienai endonukleazei, nors keli fermentai gali sutapti restrikcijos vietose. Ši vieta paprastai susideda iš trumpos palindrominės sekos, kurios ilgis yra nuo 4 iki 6 bazinių porų, tokių kaip AGCT (Alu I) ir GAATTC Eco RI.

Palindrominės sekos yra sekos, kurios, nors skaitomos 5–3 arba 3–5 kryptimis, yra tapačios. Pavyzdžiui, „Eco RI“ atveju palindrominė seka yra tokia: GAATTC ir CTTAAG.

Restrikcijos endonuklių funkcijos ir taikymai

Molekulinių biologų laimei, bakterijos evoliucijos metu sukūrė restrikcijos endonukleazių, kurios viduje suskaido genetinę medžiagą, seriją.

Gamtoje šie fermentai vystėsi, kaip spėjama, kaip bakterijų apsaugos sistema nuo svetimų DNR molekulių, tokių kaip fagai, invazijos.

Kad būtų galima atskirti vietinę ir svetimą genetinę medžiagą, šios restrikcijos endonukleazės gali atpažinti specifines nukleotidų sekas. Taigi DNR, kuri neturi šios sekos, gali būti nepažeista bakterijų viduje.

Priešingai, kai endonukleazė atpažįsta restrikcijos vietą, ji jungiasi su DNR ir ją pjauna.

Biologai yra suinteresuoti tirti gyvųjų daiktų genetinę medžiagą. Tačiau DNR yra sudaryta iš kelių milijonų bazinių porų ilgio. Šios molekulės yra ypač ilgos ir turi būti analizuojamos mažais fragmentais.

Norint pasiekti šį tikslą, restrikcijos endonukleazės yra integruotos į įvairius molekulinės biologijos protokolus. Pavyzdžiui, atskiras genas gali būti užfiksuotas ir pakartotas būsimai analizei. Šis procesas vadinamas geno „klonavimu“.

Apribojimo fragmento ilgio polimorfizmas (RFLP)

Restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmai nurodo specifinių DNR nukleotidų sekų modelį, kurį restrikcijos endonukleazės sugeba atpažinti ir iškirpti.

Dėl fermentų specifiškumo kiekvienam organizmui būdingas specifinis DNR pjovimo būdas, gaunamas įvairaus ilgio fragmentai.

Restrikcijos endonukleazių tipai

Istoriškai restrikcijos endonukleazės buvo klasifikuojamos į tris fermentų tipus, pažymėtus romėniškais skaitmenimis. Neseniai buvo aprašytas ketvirtasis endonukleazės tipas.

I tipas

Svarbiausia I tipo endonukleazių savybė yra ta, kad jie yra baltymai, sudaryti iš kelių subvienetų. Kiekvienas iš šių funkcijų yra vienas baltymų kompleksas ir paprastai turi du subvienetus, vadinamus R, du M ir vieną S.

S dalis yra atsakinga už restrikcijos vietos atpažinimą DNR. Savo ruožtu R subvienetas yra būtinas skilimui, o M yra atsakingas už metilinimo reakcijos katalizavimą.

Yra keturios I tipo fermentų pogrupiai, žinomi raidėmis A, B, C ir D, kurie yra įprasti. Ši klasifikacija grindžiama genetine komplementacija.

I tipo fermentai buvo pirmosios restrikcijos endonukleazės, kurios buvo atrastos ir išgrynintos. Tačiau labiausiai naudingi molekulinėje biologijoje yra II tipas, kuris bus aprašytas kitame skyriuje.

II tipas

II tipo restrikcijos endonukleazės atpažįsta specifines DNR sekas ir skilimą pastovioje padėtyje, artimoje sekai, kuri gamina 5 'fosfatus ir 3' hidroksilus. Paprastai kaip kofaktoriai reikalingi magnio jonai (Mg ²⁺ ), tačiau yra keletas, kuriems keliami daug konkretesni reikalavimai.

Struktūriškai jie gali pasirodyti kaip monomerai, dimeriai ar net tetramerai. Rekombinantinėje technologijoje naudojamos II tipo endonukleazės ir dėl šios priežasties buvo apibūdinta daugiau kaip 3500 fermentų.

III tipas

Šias fermentines sistemas sudaro du genai, vadinami mod ir res, kurie koduoja DNR atpažįstančius subvienetus ir modifikacijas ar apribojimus. Abu subvienetai yra būtini restrikcijai - procesas visiškai priklauso nuo ATP hidrolizės.

Norint suskaidyti DNR molekulę, fermentas turi sąveikauti su dviem ne palindrominės atpažinimo sekos kopijomis, o vietos turi būti atvirkštinės orientacijos ant substrato. Prieš plyšimą vyksta DNR perkėlimas.

IV tipas

Pastaruoju metu nustatyta papildoma grupė. Sistema sudaryta iš dviejų ar daugiau genų, koduojančių baltymus, kurie skaido tik modifikuotas DNR sekas, metilinto, hidroksimetilinto arba hidrometilinto gliukozilo.

Pavyzdžiui, fermentas EckKMcrBC atpažįsta du bendros formos RmC dinukleotidus; purinas, po kurio eina metiluotas citozinas, kurį galima atskirti keliomis bazių poromis - nuo 40 iki beveik 3000. Skilimas vyksta maždaug 30 bazių porų po vietos, kurią fermentas atpažįsta.

V tipo endonukleazės

Šio tipo endonukleazės taip pat žinomos kaip „besislepiančios“ endonukleazės. Šie fermentai atpažįsta ir išpjauna tikslinės DNR seką unikaliose genomo vietose nuo 14 iki 40 bp.

Šie fermentai dažnai koduojami intronuose ir manoma, kad jų funkcija skatina horizontalų supjaustytų sekų perkėlimą. Atlikus pjaustymą, DNR dviguboje spiralėje atsiranda pertraukos taisymas remiantis papildoma seka.

Pavyzdžiai

E. coli endonukleazė I veikia kaip gynybos sistema nuo fagų ir parazitų. Jis yra daugiausia tarp citoplazminės membranos ir ląstelės sienos. Dėl jos susidaro dvigubos svetimos DNR pertraukos, su kuriomis ji sąveikauja periplazminėje erdvėje.

CRISPR-Cas endonukleazės yra fermentai, veikiantys daugelio rūšių bakterijų gynybos mechanizmą. Jie identifikuoja ir išpjauna invazinių organizmų, kurie dažniausiai yra virusai, DNR sekas.

Neseniai Masačusetso technologijos instituto (MIT) tyrėjai labai tiksliai nustatė CRISPR-Cas12bm genomo redagavimo sistemą žmogaus ląstelių modifikavimui.

Nuorodos

1. Burrell, MM (Red.). (1993). Molekulinės biologijos fermentai. Totowa, NJ: „Humana Press“.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA ir Wilson, GG (2013). I tipo restrikcijos fermentai ir jų artimieji. Nukleorūgščių tyrimai, 42 (1), 20–44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS ir Pfaller, MA (2017). Medicininė mikrobiologija + ispanų kalba StudentConsult + StudentConsult. Elsevier sveikatos mokslai.
4. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restrikcijos endonukleazės analizuojant ir pertvarkant DNR molekules. Metinė biochemijos apžvalga, 44 (1), 273–293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). II tipo restrikcijos endonukleazės: struktūra ir mechanizmas. Ląstelių ir molekuliniai gyvybės mokslai, 62 (6), 685.