PROTEINAZĖS K: SAVYBĖS, FERMENTINIS AKTYVUMAS, PRITAIKYMAI - BIOLOGIJA - 2025

K proteinazės yra fermentas, priklausantį serino proteazių grupės, ty, ji turi savo viduriniosios katalitiškai aktyvus aminorūgščių serino ir turi suskaidyti peptidines obligacijas hidrolizės būdu funkciją. Savo ruožtu šis fermentas priklauso subtilisinų baltymų (peptidazės S8) šeimai.

Proteinazės K molekulinė masė (MW) yra 28 900 daltonų. Ji pirmą kartą buvo išskirta 1974 m. Iš grybelio Engyodontium albumo, anksčiau žinomo kaip Tritirachium album Limber, ištraukose.

Proteinazės K. molekulinė struktūra. Šaltinis: Lykchiniadis

Jis pasižymi dideliu proteolitiniu gebėjimu, kurį parodo gebėjimas skaidyti plaukuose esantį keratiną. Žodis keratinas anglų kalba yra parašytas „keratinas“, todėl jis buvo vadinamas „proteinase K“.

Šis fermentas yra labai naudingas natūraliems baltymams skaidyti, todėl yra naudingas atliekant įvairius molekulinės biologijos metodus. Pirmiausia jis naudojamas aukštos molekulinės masės (MW) nukleorūgštims išskirti ir paruošti.

Proteinazė K veikia atpalaiduodama branduolinę DNR, tuo pačiu sunaikindama baltymus ir inaktyvuodama RNazes ir DNazes, tai yra, pašalina nukleazes DNR ir RNR preparatuose.

Kita vertus, buvo pastebėta, kad proteinazė K gali hidrolizuoti kai kuriuos denatūruotus natūralius baltymus, o tai sukėlė tyrėjų susidomėjimą jo naudojimu prioninių baltymų (PrPC) tyrimams.

Nepaisant jų stiprios proteolitinės potencijos, yra baltymų, kurie yra atsparūs proteinazės K veikimui. Tarp jų yra keletas nenormalių baltymų, vadinamų prionais (PrPSc), susijusių su užkrečiama spongiformine encefalopatija.

Proteinazės K savybės

Proteinazės K tretinė struktūra yra sudaryta iš trijų sluoksnių, tarp septynių grandinių β lakšto, išdėstyto tarp dviejų sraigtų sluoksnių. Kadangi jis priklauso S8 peptidazių šeimai, jam būdinga, kad jo aktyviojoje vietoje yra katalizinė triada, kurios seka yra (Asp, His ir Ser), kuri juos išskiria iš kitų peptidazių šeimų.

Šis ferinas iš serino proteazių grupės pasižymi peptidinių ryšių hidrolizavimu, artimu alifatinių ir aromatinių aminorūgščių karboksilo grupei.

Kita vertus, jis yra pajėgus veikti esant tam tikroms ėsdinančioms medžiagoms, tokioms kaip natrio dodecilsulfatas (SDS), Tris-HCL ir EDTA, kurios yra naudojamos baltymams denatūruoti, todėl jos praranda savo prigimtinę struktūrą.

Tai yra išankstinis baltymų paruošimo elektroforezės metodu žingsnis. PH diapazonas, kuriame veikia proteinazė K, yra gana platus (nuo 2,0 iki 12,0), o optimalus pH yra nuo 7,5 iki 12,0, o jo izoelektrinis taškas yra 8,9. Kaip matyti, jis yra aktyvus esant labai plačiam pH diapazonui.

Kita proteinazėje K išsiskirianti savybė yra jos stabilumas esant aukštai temperatūrai (50–60 ° C).

Fermentinė veikla

Proteinazei K reikia kalcio jonų, nors tai neturi įtakos jo veiklai, jei tai būtina norint išlaikyti jo stabilumą.

Kad proteinazė K galėtų pilnai suvirškinti substratą, reikalingas maždaug 5 minučių - 2 valandų sąlyčio laikas.

Tačiau šia prasme Daza ir kt. Palygino DNR, gautos įvairiu ekspozicijos metu, grynumą su proteinaze K, ir padarė išvadą, kad ilgas inkubavimas (iki 24 h) žymiai pagerina DNR kokybę.

Tačiau, kalbant apie skirtinguose protokoluose naudojamo fermentazės K fermento koncentraciją, galima pasakyti, kad jis yra labai įvairus.

Jis gali būti naudojamas nuo labai mažos koncentracijos (5 μg / ml) iki 500 μg / ml. Tačiau dažniausios darbinės koncentracijos yra nuo 50–100 μg / ml, ypač baltymų virškinimui ir nukleazės inaktyvavimui. Nors audiniams gydyti reikalinga 2 mg / ml koncentracija.

Programos

Jos taikymo sritys yra labai plačios ir jas galima apibendrinti taip:

-Jis naudojamas baltymų virškinimui ir DNR ekstrakcijai įvairiais būdais, tokiais kaip: sūdymas, PK-SDS, cetil-trimetil-amonio bromidas (CTAB), modifikuotas kalio acetatas ir ekstrahavimas natrio jodidu.

-Nukleazių (RNazių ir DNazių) aktyvacija.

- In situ hibridizacijos metode (HIS), siekiant palengvinti nukleorūgšties išsiskyrimą, pašalinant nepageidaujamus baltymus.

- Baltymų modifikavimas.

-Tyrimo lygmenyje, atliekant įvairius tyrimus.

Proteinazės K pranašumai

Buvo atlikta keletas lyginamųjų tyrimų tarp DNR ekstrahavimo metodų, kuriuose naudojama proteinazė K, su kitais, kurie jo nenaudoja, ir visi daro išvadą, kad naudojant fermentą yra didesnė nauda. Privalumai yra šie:

Gaunama aukštos molekulinės masės, aukštos kokybės ir grynumo DNR.

-Ištraukta DNR yra stabili iki 3 mėnesių.

Išgauta DNR gali būti naudojama šiais būdais: Southern blot, polimerazės grandinine reakcija (PGR), elektroforeze, be kita ko.

Proteinazei K atsparūs baltymai

Įvairūs tyrimai padarė išvadą, kad prionai (nenormalūs toksiški PrPSc baltymai) skiriasi nuo PrPC (natūraliųjų) baltymų tuo, kad yra atsparūs proteinazės K veikimui, tuo tarpu PrPC yra jautrūs jo veikimui.

Kiti autoriai aprašė, kad PrPSc struktūroje yra jautrios dalys, o kitos yra atsparios proteinazei K. Tačiau abi dalys yra vienodai toksiškos ir infekcinės.

Kita vertus, Bastian ir kt., 1987 m., Iš Spiroplasma mirum rūšies išskyrė 4 baltymus, kurių 28, 30, 66 ir 76 kda. Buvo nustatyta, kad visi jie yra atsparūs proteinazės K veikimui, taip pat turėjo kryžminę reakciją su kai kuriais prionais.

Yra žinoma, kad ši rūšis gali sukelti kataraktą ir didelę neurologinę žalą, todėl dėl Bastiano mokslinių išvadų, be kitų tyrimų, buvo bandoma susieti šį mikroorganizmą su užkrečiama spongiformine encefalopatija.

Tačiau šios degeneracinės neurologinės patologijos etiologija ir toliau priskiriama prionams.

Šia prasme Butleris ir kt. 1991 m. Nustatė ir apibūdino 40 kda baltymų, atsparių proteinazei K, klasę iš dviejų Mycoplasma hyorhinis padermių. Šis patogenas veikia kiaules, užkrėsdamas jų audinius, tačiau šiuo atveju kryžminės reakcijos su tirtais prionais nebuvo.

Reikia išsiaiškinti daugelį nežinomų šiuo atžvilgiu klausimų.

Nuorodos

1. Bastian F, Jennings R ir Gardner W. 1987. Ant skreplių susietų fibrilių baltymų antiserumas kryžmiškai reaguoja su Spiroplasma miru fibrilių baltymais. J. Clin. Mikrobiolis. 25: 2430–2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. DNR ekstrahavimo ir gryninimo iš formaldehidu fiksuoto raumens audinio, nenustatyto iki galo, įvertinimas. Žurnalas „Med“, 2014; 22 (1): 42–49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E, ir Mcgarrity G. Proteinase K-atsparių baltymų identifikavimas ir apibūdinimas klasės moliuskais. Infekcija ir imunitetas, 1991, 59 (3): 1037-1042
4. „López M“, „Rivera M“, „Viettri M“, „Lares M“, „Morocoima A“, „Herrera L“ ir kt. Dviejų aksoninėje terpėje išaugintų DNR ekstrakcijos iš Trypanosoma bandymų palyginimas. Peru atšventimas. Visuomenės sveikatos 2014 m. 31 (2): 222–227. Galima rasti: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E ir Palma W. Penkių DNR ekstrahavimo protokolų iš parafinuotos medžiagos efektyvumo nustatymas molekuliniams tyrimams. Rev Méd Univ Kosta Rika. 2007; 1 (1): 10–19.