MIULERIO HINTONO AGARAS: PAGRINDAS, PARUOŠIMAS IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Mueller Hinton agaras nėra atrankinė, kietas maistinių medžiagų terpė yra sudaryta iš mėsos infuzijos, peptono rūgštinio kazeino, krakmolo, agaras ir distiliuotas vanduo. Ši terpė suteikia puikų mikrobų augimą daugumai greitai augančių bakterijų.

Jį iš pradžių sukūrė Johnas Howardas Miuleris ir Jane Hinton, norėdami atskirti tokias mitybines bakterijas kaip Neisseria gonorrhoeae ir Neisseria meningitidis. Tačiau dėl savo savybių jis pasirodė idealus jautrumo antibiotikams tyrimams, teikiant patikimus ir atkuriamus rezultatus.

Antibiogramos (Müeller Hinton agaras). Šaltinis: Dr Graham Beards svetainėje en.wikipedia

Todėl Müeller Hinton agaras yra mitybinė terpė, kurią priėmė Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas (CLSI) ir Europos antimikrobinio jautrumo tyrimų komitetas, skirtą atlikti antimikrobinio jautrumo testą Kirby disko difuzijos metodu ir Baueris.

Pagrindas

Būdama neselektyvi mitybinė terpė, ji puikiai tinka daugiausiai patogeninių bakterijų dauginimuisi.

Kita vertus, dėl paprastos sudėties medžiagos lengvai pasklinda ant jo, nes tai yra esminė charakteristika atliekant jautrumo testą disko difuzijos metodu.

Kitas jo bruožas yra tas, kad jame yra nedidelis inhibitorių kiekis, kuris leidžia efektyviai įvertinti sulfonamidus, trimetoprimą ir tetraciklinus.

Tačiau reikia turėti omenyje, kad, norint užtikrinti tinkamą jos veikimą, laikmena turi atitikti tam tikras sąlygas, įskaitant:

PH, agaro gylio ir tinkamos timino, timidino, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ ir Zn ⁺⁺ koncentracijos sureguliavimas .

Jūs taip pat turite žinoti, kad metodika yra standartizuota, todėl turi būti laikomasi visų parametrų, tokių kaip:

Inokulumo koncentracija, antibiotikų diskų koncentracija ir išsaugojimas, tinkamo diskų skaičiaus įdėjimas į agarą, atstumas tarp vieno disko ir kitas, strateginis tam tikrų antibiotikų įdėjimas, atmosfera, temperatūra ir laikas. inkubacija.

Paruošimas

Pasverkite 37 g dehidratuotos „Müeller Hinton“ terpės ir ištirpinkite 1 litre distiliuoto vandens. Šilumos terpę maišant palengvinkite. Virinama 1 minutę.

Autoklavas 15 minučių sterilizuojamas 121 ° C temperatūroje. Išimdami iš autoklavo, kolba turi būti dedama į 50 ° C vandens vonią, kad atvėstų. Supilkite 25–30 ml į sterilius 10 cm skersmens Petri lėkšteles.

Vidutinis plokščių storis turi būti 4 mm (idealus), leidžiamas diapazonas 3-5 mm.

Jei norima paruošti kraujo agarą, naudojant pagrindą „Müeller Hinton“ agarą, prieš patiekdami į lėkštes, užpilkite 5% sterilaus ir defibrinuoto ėriuko kraujo.

Galutinis terpės pH turėtų būti nuo 7,2 iki 7,4.

Investuokite ir laikykite šaldytuve iki vartojimo. Prieš naudojimą leiskite plokštelei atvėsti iki kambario temperatūros.

Paruoštos terpės spalva yra šviesiai smėlio spalvos.

Programos

Jis naudojamas greitai augančių nepageidaujamų patogenų antibiotikų arba antibiotikų jautrumo tyrimui atlikti.

Jei agaras yra papildytas krauju, jis naudojamas atlikti reikalaujančių mikroorganizmų, tokių kaip: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, antibakterinę schemą. Jis taip pat buvo naudojamas Legionella pneumophila izoliacijai.

Antibiogramos technika

Prieš atliekant antibiotikogramos, bakterinė tirpalas, atitinkančio 1,5 x 10 ⁸ ląstelių turi būti paruošti .

Tuo tikslu paimamos 3–4 grynos kultūros kolonijos ir suspenduojamos sojos pupelių tryptazės sultinyje arba Müeller Hinton sultinyje, inkubuojamos 2–6 valandas ir koncentracija sureguliuojama steriliu druskos tirpalu, palyginus ją su Mac Farland standartu. 0,5%.

Jei jie reikalauja mikroorganizmų, kolonijas galima tiesiogiai suspenduoti iki 0,5% Mac Farland koncentracijos. Vėliau Müeller Hinton plokštelė pasėjama tamponu, įmirkytu paruoštu bakterijų tirpalu.

Tam tamponas panardinamas į tirpalą, o perteklinis skystis pašalinamas prispaudžiant prie vamzdelio sienelių. Iškart po to tamponas praeinamas per visą paviršių, nepaliekant nepaliestų vietų, tada plokštelė šiek tiek pasukama ir vėl sėjama. Operacija pakartojama dar 2 kartus.

Leiskite pastovėti 10 minučių ir tada įdėkite antibiotikų diskus steriliais žnyplėmis, palikdami tarp jų 24 mm tarpą. Uždėję kiekvieną diską ant agaro, kiekvieną diską lengvai paspauskite žnyplėmis, kad jie gerai priliptų.

Baigę procesą, plokštelė apverčiama ir inkubuojama 35–37 ° C temperatūroje aerobiozės metu 16–18 valandų. Jei tai yra reiklus mikroorganizmas, jis gali būti vertas mikroaerofilijos, o jei antiiogramoje yra oksacilino diskų, jis turėtų būti perskaitytas po 24 valandų.

Kiekvienos halogeno skersmeniui išmatuoti naudojama liniuotė. Rezultatai turėtų būti užrašomi milimetrais. Vėliau gautos vertės koreliuojamos su ribų taškų lentelėmis, paskelbtomis dabartiniame CLSI vadove.

Slopinimo halogeno matavimas. Šaltinis: USCDCP, Pixnio.com

Nurodoma kaip jautri (S), tarpinė (I) arba atspari (R).

Antibiotikai parenkami atsižvelgiant į išskirtą mikroorganizmą ir jo sukeliamos infekcijos tipą.

Kartais reikia atsiminti strateginį antibiotikų skyrimą, kad būtų atskleisti fenotipiniai atsparumo modeliai.

Strateginis disko išdėstymas Müeller Hinton agare

Esant enterobakterijoms, klavulano rūgšties diskas turėtų būti dedamas prieš trečiosios ir ketvirtosios kartos cefalosporinus. Kiaušinio formos išsiplėtimas rodo, kad štamas yra išplėstinio spektro beta laktamazių (ESBL) gamintojas. Tai reiškia, kad pacientas neturėtų būti gydomas jokiais cefalosporinais.

Fenotipinė išplėstinio spektro beta-laktamazių (ESBL) produkcijos ekspresija Escherichia coli padermėje. Šaltinis: autoriaus nuotr. Magistrantūra. Marielsa gil

Stafilokoko metu svarbu įdėti eritromicino arba azitromicino diską priešais klindamicino diską (D-testas).

Atsparus eritromicino halogenas ir klindamicino halogenos išlyginimas rodo, kad štamas turi padermėms indukuojamą atsparumą klindamicinui (ICR). Tai reiškia, kad gydymas klindamicinu nebus efektyvus.

Norėdami ieškoti indukuojamų AMP C padermių enterobakterijose ir kai kuriuose nefermentuojančiuose gramneigiamuose lazdelėse, tazobaktano ceftazidimo, cefoksitino ar piperacilino diskai susiduria su imipenemo disku, esančiu 27 mm atstumu.

Plokščias halogenas viename iš diskų, nukreiptų į imipenemą, rodo indukuojamą AMP C.

Konstitucinio C-AMP paieškai 500 μg kloksacilino diskas yra veikiamas ceftazidimo (30 μg) ir cefotaksimo (30 μg) 25 mm atstumu. Išsiplėtęs bet kurio cefalosporinų halogenas rodo teigiamumą.

Kloksacilino diską taip pat galima pakeisti 9 mm filtru „Whatman“ Nr. 6 filtravimo popieriumi, įmirkytu fenilo boro rūgštimi (400 µg), kurio atstumas 18 mm. Jis aiškinamas taip pat, kaip ir ankstesnis.

Galiausiai, norint ištirti metalobetalaktamazių gamybą, ypač Pseudomonas aeruginosa, naudojamas diskas, įmirkytas 10 µl etilengndiamintetraacto rūgšties (EDTA 750 µg) ir tioglikolio rūgšties (SMA 300 µg), susidūrusio su imipenemo ir meropenemo diskais, 15 mm atstumu.

Testas yra teigiamas, jei imipenemo ar meropenemo halos išsiplečia EDTA / SMA disko link. Šis rezultatas turi būti patvirtintas modifikuotu Hodge'o bandymu.

Šis metodas susideda iš Escherichia coli ATCC 25922 padermės pasėjimo į Müeller Hinton plokštelę. Plokštės centre dedamas imipenemo diskas, tada iš disko į periferiją su įtariamu P. aeruginosa kamienu sudaromas ruožas. Vienoje plokštelėje galima ištirti iki 4 atmainų.

Testas bus teigiamas, jei aplink strijų yra imipenemo halo iškraipymo zona.

Klaidingų rezultatų priežastys

- Prastai išsilaikę antibiotikų diskai gali sukelti klaidingą atsparumą. Pavyzdžiui, oksacilino diskas yra labai pažeidžiamas temperatūros pokyčių.

- Esant mažesnei nei nurodyta (rūgštinė) terpės pH, aminoglikoziduose ir makroliduose susidaro mažesni halogenai (klaidingo atsparumo rizika), o penicilinuose, tetraciklinuose ir novobiocinuose yra daugiau halogenų (klaidingo jautrumo rizika).

-Jei pH yra didesnis nei nurodyta (šarminis), aukščiau aprašytas poveikis yra priešingas.

- Medžiagos, kuriose yra didelė timino ir timidino koncentracija, daro įtaką žymiai sumažindamos sulfonamidų ir trimetoprimo slopinimą.

-Aukštos kalcio ir magnio koncentracijos sukelia klaidingą aminoglikozidų, polimiksino B ir tetraciklinų atsparumą Pseudomonas aeruginosa padermėms.

- Žemos kalcio ir magnio koncentracijos sukelia klaidingą aminoglikozidų, polimiksino B ir tetraciklinų jautrumą Pseudomonas aeruginosa kamienams.

-Cinko buvimas turi įtakos karbapenemo diskų (imipenemo, meropenemo ir ertapenemo) rezultatams.

-Dėl terpės storio, mažesnio nei 3 mm, gaunami klaidingi jautrumo rezultatai, tuo tarpu, kai storis didesnis nei 5, sukels klaidingą atsparumą.

- Diskų mobilizavimas antiiogramoje duos deformuotus halus, nes antibiotikai išleidžiami nedelsiant.

- Labai silpni užpilai daro įtaką rezultatams, nes agare nebus vienodo ar susiliejančio augimo - tai būtina sąlyga, kad būtų galima išmatuoti slopinamuosius halus, be to, kad halos gali duoti daugiau nei įprasta.

-Vaikai pakrautos inokulės gali duoti mažesnių nei įprasta halų.

- Nepaisant atstumo tarp diskų, vienas halogenas sutampa su kitu ir jo negalima tinkamai perskaityti.

-Incubate su CO ₂ padidina tetraciklino ir meticilinui diskų halogenų dydžio.

-Inkubuojant mažesnėje nei 35 ° C temperatūroje susidaro didesni halos.

- Pridėjus kraujo, sumažėja sulfa halogenų dydis.

Ribojimas

Antibigramoje parodytas antibiotiko jautrumas mikroorganizmui (in vitro) negarantuoja, kad jis veiks in vivo.

QA

Norint žinoti, ar terpėje yra pakankamas kiekis timino, reikia pasodinti Enterococcus faecalis ATCC 29212 kamieną ir patikrinti jautrumą trimetoprimo sulfametoksazoliui (SXT). Jame turi būti halogenas, lygus arba didesnis kaip 20 mm, kad būtų patenkinamas.

Nuorodos

1. "Müller-Hinton agaras". Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2018 m. Lapkričio 16 d., 12:23 UTC. 2019 m. Sausio 27 d., 04:22
2. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey ir Scotto mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Redakcija Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Gero jautrumo tyrimo sąlygos agaro difuzijos testu. „Chv Infect“, 2002; 19 (2): 77–81
4. „Difco Francisco Soria“ Melguizo laboratorija. Müeller Hinton agaras su 5% avių krauju. 2009.Atsiejama: http://f-soria.es
5. „BD Müeller Hinton II“ agaro laboratorija. 2017.Atsiejama: .bd.com
6. „Britannia“ laboratorijos. Miulerio Hintono agaras. 2015.Atsiejama: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5-asis leidimas Redakcija Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. AmpC tipo betalaktamazės: fenotipo nustatymo bendrumai ir metodai. Soc. Ven. Mikrobiolis. 2009; 29 (2): 78–83. Galima rasti: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotipinis metallobetalaktamazių nustatymas klinikiniuose Pseudomonas aeruginosa izoliatuose. „Kasmera“, 2012; 40 (2): 113–121. Galima rasti: scielo.org.