AGARO PONIA: PAGRINDAS, PARUOŠIMAS IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Agaro PONIA yra selektyvus kieta terpė kultūra naudojamas izoliacijos ir suskaičiuojamos pieno rūgšties bakterijų, ypač genties Lactobacillus. Šį agarą 1960 m. Sukūrė „Man“, „Rogosa“ ir „Sharpe“, nešini tuo pačiu pavadinimu, tačiau dėl savo sudėtingumo dažnai naudojama santrumpa MRS.

Jį sudaro baltyminis peptonas, mėsos ekstraktas, mielių ekstraktas, gliukozė, sorbitano monoleatas, dikalio fosfatas, natrio acetatas, amonio citratas, magnio sulfatas, mangano sulfatas ir agaras.

Žmogus Rogosa ir Sharpe Agaras (MRS) pasėjo Lactobacillus sp. Šaltinis: Nuotrauka, paaukota šiam straipsniui, autoriai: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Nuotrauka padaryta tyrimo metu pavadinimu: Pieno rūgšties bakterijų ir probiotinį potencialą turinčių bifidobakterijų įvertinimas motinos piene ir kūdikių išmatose. .

Ši kompozicija leidžia tinkamai vystytis pieno rūgšties bakterijoms iš klinikinių mėginių, tokių kaip išmatos, makšties išskyros, burnos mėginiai ir motinos pienas, taip pat pieno ir mėsos maistas.

Jis nėra reguliariai naudojamas klinikinėse laboratorijose, nes pieno rūgšties bakterijos retai dalyvauja ligos procesuose. Tačiau maisto mikrobiologijos srityje MRS agaras naudojamas dažniau.

Kita vertus, šią terpę naudoja kai kurie tyrimų centrai, kurių tikslas yra pieno rūgšties bakterijų tyrimas.

Pagrindas

Žmogaus, Rogosa ir Sharpe agarų sudėtis yra gana sudėtinga. Suskaidžius kiekvieno komponento funkciją, galima paaiškinti jo pagrindą.

Proteoso peptonas, mėsos ekstraktas, mielių ekstraktas ir gliukozė yra maistinės medžiagos, kurios suteikia anglies, azoto, vitaminų ir mineralų, reikalingų bakterijoms augti, šaltinį. Be to, gliukozė yra universalus energijos šaltinis, naudojamas daugumoje kultūrų terpių.

Kita vertus, norint skatinti pieno rūgšties bakterijų dauginimąsi, būtini kofaktoriai (katijonai), būtini Lactobacillus ir susijusių bakterijų metabolizme; Šie junginiai yra natrio, magnio ir mangano druskos.

Taip pat sorbitano monoleatas arba polisorbatas 80 yra svarbus riebalų rūgščių šaltinis, nes jie pasisavinami kaip maistinės medžiagos.

Be to, sorbitano monoleatas ir amonio citratas slopina lydinčios floros, ypač gramneigiamų bakterijų, vystymąsi ir suteikia šio agaro selektyvų pobūdį.

Galiausiai agaras-agaras suteikia terpei kietą konsistenciją.

Yra ir kitų „Man Rogosa Sharpe“ agaro variantų; vienas iš jų yra papildytas cisteinu (MRSc), labai naudingu bifidobakterijoms išskirti, be kitų mikroorganizmų. Kita vertus, yra MRS terpė, papildyta neomicinu, paromomicinu, nalidikso rūgštimi ir ličio chloridu, specialiai selektyviam bifidobakterijų skaičiavimui pieno produktuose.

Paruošimas

Pasveriama 68,25 g dehidratuotos terpės ir ištirpinama viename litre distiliuoto vandens. Leiskite pastovėti 5 minutes. Norėdami visiškai ištirpti, dažnai maišydami, pasukite į šilumos šaltinį ir virkite 1–2 minutes. Sterilizuokite autoklave 121 ° C temperatūroje 15 minučių.

Palikdami autoklavą, palikite keletą minučių pastovėti ir dar karštą paskirstykite steriliuose Petri induose.

Leiskite sukietėti ir apverskite plokšteles, sudėkite į plokščių lentynėles ir atšaldykite iki naudojimo. Prieš naudojimą leiskite plokštelėms sušilti iki kambario temperatūros.

Terpės pH turėtų būti 6,4 ± 0,2. Kai kurių komercinių namų pH yra nuo 5,5 iki 5,9.

Dehidratuota terpė yra smėlio spalvos ir paruošta tamsiai gintaro spalvos.

Tiek dehidratuota terpė, tiek paruoštos plokštelės turėtų būti laikomos 2–8 ° C temperatūroje.

Programos

MRS agaro lėkštelės gali būti sėjamos į paviršių (išsekimas arba „Drigalski“ mentele). Taip pat galima sėti pagal gylį. Plokštelės turėtų būti inkubuojamos 37 ° C temperatūroje mikroaerofiliškumu (4% O ₂ ir 5-10% CO ₂ ) nuo 24 iki 72 valandų.

Sėjos būdas parenkamas atsižvelgiant į siekiamą tikslą (izoliaciją ar skaičiavimą).

Kolonijų charakteristika

Spėjamos Lactobacillus kolonijos yra balkšvos spalvos ir šiame agare turi mucoidinį ar kreminį pavidalą. Vėliau jie turi būti identifikuoti.

Pieno rūgšties bakterijų išskyrimas

Tam naudojamas paviršiaus sėjimas. Sėjamiems mėginiams reikalinga ankstesnė procedūra.

Tiriant motinos pieno mėginius, rekomenduojama 10 minučių centrifuguoti 1 ml mėginio esant 14 000 aps./min., Kad būtų pašalintas riebalų sluoksnis. 900 µl išpilama, o likusiuose 100 µl nuosėdos suspenduojamos ir pilamos ant MRS agaro paviršiaus, tada jas reikia tolygiai paskirstyti Drigalski mentele.

Išmatų pavyzdžių atveju pasveriamas vienas (1) gramas išmatų ir homogenizuojamas 9 ml 0,1% sterilaus peptono vandens, atitinkančio 1/10 praskiedimą. Tada daromi nuoseklieji skiedimai, kol gaunamas galutinis praskiedimas nuo 10 iki ⁴ .

Galiausiai imama 100 µl ^10–2 , ^10–3 ir ^10–4 skiedimų ir kiekvienas skiedimas pasėjamas MRS agare, tolygiai paskirstant Drigalski mentele.

Pieno rūgšties bakterijų skaičius

Tokiu atveju sėjama pagal gylį.

Tiriant motinos pieno mėginius, paimamas 1 ml tirpalas ir įpilamas į sterilų kūginį plastikinį mėgintuvėlį. Maždaug 40 ° C temperatūros MRS agaras pridedamas prie galutinio 25 ml tūrio, gaunant homogeninį mišinį. Vėliau jis tolygiai supilamas į sterilius Petri indus ir paliekamas pastovėti iki polimerizacijos.

Išmatų mėginiai skiedžiami, kaip aprašyta anksčiau. Paimkite 1 ml kiekvieno skiedimo ir įdėkite į sterilius kūginius plastikinius mėgintuvėlius. Ištirpintas MRS agaras pridedamas prie 25 ml tūrio.

Kiekvieno skiedimo mišinys tolygiai pilamas į sterilius Petri lėkšteles. Galiausiai paliekama pailsėti iki polimerizacijos.

Kolonijų skaičius priklauso nuo Man Rogosa ir Sharpe (MRS) agaro. Šaltinis: šiam straipsniui paaukota nuotrauka. Autoriai: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Nuotrauka padaryta tyrimo metu pavadinimu: Pieno rūgšties bakterijų ir bifidobakterijų, turinčių probiotinį potencialą, įvertinimas motinos piene ir kūdikių išmatose.

Tyrimo lygis

Kiekvieną dieną pieno rūgšties bakterijų tyrimas sulaukia vis didesnio susidomėjimo; Tyrėjai ypač siekia sužinoti apie naujas padermes ir jų, kaip pradinių fermentų, galimybes standartizuoti pieno produktų gamybą, be kitų naudojimo būdų.

Šia prasme Alvarado ir kt. (2007) naudojo MRS agarą tyrimui, kurio metu jie išskyrė, identifikavo ir apibūdino pieno rūgšties bakterijas, esančias amatiniame Venesuelos Andų rūkytame sūryje.

Sūryje jie nustatė Lactococcus ir Lactobacillus genčių bakterijas ir padarė išvadą, kad išskirtų padermių mišiniai yra tinkami kaip pradiniai štamai gaminant sūrius iš pasterizuoto pieno.

Kita vertus, Sánchez ir kt. (2017) naudojo MRS agarą, kad ištirtų pieno rūgšties bakterijas paršelių virškinamajame trakte, kad galėtų jas naudoti kaip vietinius probiotikus, kurie padidina sveikų paršelių produktyvumą.

Su šia terpe jiems pavyko išskirti keturias rūšis: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae ir Pediococcus pentosaceus.

Taip pat Báez ir kt. (2019) naudojo MRS agarą pieno rūgšties bakterijų (LAB) ir bifidobakterijų, turinčių probiotinį potencialą, vertinimui motinos piene ir kūdikių išmatose.

Jiems pavyko išskirti 11 BAL ir 3 Bifidobakterijų sp motinos piene ir 8 BAL ir 2 Bifidobacteria sp. išmatose. Visi atitiko tam tikrus parametrus, kurie įrodo, kad jie yra bakterijos, turinčios probiotinį aktyvumą.

Autoriai padarė išvadą, kad tiek motinos pienas, tiek išimtinai tik žindomų kūdikių išmatos yra natūralūs probiotinių bakterijų šaltiniai.

QA

Norėdami įvertinti MRS agaro kokybę, naudokite tokias kontrolines padermes kaip:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358 ir Escherichia cereus.

Laukiami rezultatai yra patenkinamas pirmųjų 6 bakterijų augimas, tuo tarpu E. coli ir Bacillus cereus turi būti visiškai slopinami.

Nuorodos

1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Pieno rūgščių bakterijų iš Venesuelos rūkyto Andų artišolių sūrio išskyrimas, identifikavimas ir apibūdinimas. Jo naudojimas kaip pradedančiųjų kultūra. Cient. (Marakaibas) 2007; 17 (3): 301–308. Galima rasti: scielo.org.
2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Pieno rūgšties bakterijų išskyrimas iš paršelio virškinamojo trakto. Kun. vet. Peru 2017; 28 (3): 730–736. Galima rasti: scielo.org.
3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Pieno rūgšties bakterijų ir bifidobakterijų, turinčių probiotinį potencialą, įvertinimas motinos piene ir kūdikių išmatose Acevedo savivaldybėje, Miranda 2017 m. Bakalauro darbas norint gauti bakalauro laipsnį Bioanalizė. Karabobo universitetas, Venesuela.
4. Britanijos laboratorija. MRS agaras. 2015.Atsiejama: britanialab.com
5. Vikipedijos bendradarbiai. MRS agaras. Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2018 m. Sausio 10 d., 19:44 UTC. Galima rasti: wikipedia.org Prieiga prie 2019 m. Vasario 17 d.
6. Roy D. Bifidobakterijų pieno produktuose išskyrimo ir skaičiavimo terpės. Int J maisto mikrobiolis, 200128; 69 (3): 167–82.