SABOURAUDO AGARAS: PAGRINDAS, PARUOŠIMAS IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

Agaro Sabouraud , taip pat žinomas kaip Sabouraud dekstrozės agaro, yra kieta terpė, ypač praturtintos izoliacijos ir vystymosi grybų, pavyzdžiui, mielių, liejimo formos ir dermatofitų.

Todėl šios terpės trūksta mikrobiologijos laboratorijoje, kad būtų galima ištirti patogeninių ar oportunistinių grybelių buvimą iš klinikinių ar neklinikinių mėginių. Be to, jis idealiai tinka pluoštinių bakterijų, tokių kaip Streptomyces ir Nocardias, daugėjimui. Jo paskirtis labai plati, nes gali būti naudojama žmonių, gyvūnų, augalų ir pramonės mikologijoje.

A. Neraugintas Sabouraudo agaras. B. Sabouraudo agaras pasėtas mielėmis. Šaltinis: Nuotraukos padarytos magistrantūros. Marielsa gil

Šią terpę 1896 m. Sukūrė žymus dermatologas Raimondas Sabouraudas, tapęs visame pasaulyje žinomu galvos odos pažeidimų, kuriuos daugiausia sukelia dermatofitai, specialistu.

Jos sukūrimas buvo toks svarbus, kad nuo to laiko buvo naudojamas ir tebėra šiandien, nors ir su tam tikrais pakeitimais.

Nors bakterijos yra ypatingos grybeliams, šioje terpėje gali augti bakterijos, todėl mėginiuose su mišria flora reikia įtraukti antibiotikus į jų paruošimą, kad būtų užkirstas kelias bakterijų floros, kuri gali būti, augimui.

Antibiotiką reikia pasirinkti atsargiai ir atsižvelgiant į atkuriamo grybelio tipą, nes kai kurie vaistai slopinami esant tam tikroms medžiagoms.

Pagrindas

Sabouraud dekstrozės agaras yra terpė, kurios pradinė kompozicija yra silpnai selektyvi dėl rūgštinio pH 5,6 ± 0,2, tačiau vis tiek gali vystytis bakterijos, daugiausia užsitęsus inkubacijai.

Terpėje yra kazeino peptono ir kasos gyvūninių audinių virškinimo medžiagų, kurios suteikia anglies ir azoto šaltinį mikroorganizmams augti.

Jame taip pat yra didelė gliukozės koncentracija, kuri veikia kaip energijos šaltinis ir skatina grybelių augimą per bakterijas. Visa tai sumaišoma su agaru-agaru - komponentu, kuris suteikia jam reikiamą konsistenciją.

Kita vertus, pridedant antibiotikų, Sabouraud dekstrozės agaras gali būti selektyvus.

Naudojant antibiotikus, jis ypač naudingas žaizdų, atvirų opų arba bet kokio mėginio, kuriame įtariamas didelis bakterinis užterštumas, mėginiuose.

Dažniausiai naudojami „Sabouraud“ dekstrozės agaro ir antibiotikų deriniai

-Saburaudo agaras su chloramfenikoliu: idealiai tinka mielėms ir gijiniams grybeliams atstatyti.

- Sabouraudo agaras su gentamicinu ir chloramfenikoliu: šioje terpėje auga beveik visi gijiniai grybai ir mielės, jis slopina daugybę bakterijų, įskaitant Enterobacteriaceae, Pseudomonas ir Staphylococcus.

- Sabouraudo agaras su cikloheksimidu: ypač naudingas imant mėginius iš odos ar kvėpavimo takų, jei įtariama, kad tai dimorfiniai grybeliai.

Cikloheksimidą reikia vartoti atsargiai; Nors jis naudojamas ne patogeninių ar aplinkos grybelių ir mielių, kurie gali būti kaip teršalai, augimui mėginyje, jis taip pat slopina kai kurių grybų, tokių kaip Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp ir kitų oportunistinių grybų, augimą.

- Sabouraudo agaras su chloramfenikoliu ir cikloheksimidu: jis daugiausia naudojamas dermatofitų ir dimorfinių grybelių išskyrimui. Jo trūkumas yra tas, kad jis slopina kai kurias oportunistinių grybų rūšis, tokias kaip Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes ar C. neoformans.

- Sabouraudo agaras su chloramfenikoliu, streptomicinu, penicilinu G ir cikloheksimidu: jis yra idealus mėginiams, ypač užterštiems bakterijomis ir saprofitiniais grybeliais, tačiau, be aukščiau paminėtų oportunistinių grybų, jis slopina ir Actinomyces bei Nocardias augimą.

Paruošimas

Jei ingredientų turite atskirai, juos galima paruošti taip:

Sabouraudo dekstrozės agaras

Sverti:

- 40 gr dekstrozės

- 10 g peptono

- 15 gr agaro-agaro

- Išmatuokite 1000 ml distiliuoto vandens

Visi ingredientai sumaišomi, pH sureguliuojamas iki 5,6. Tirpios medžiagos ištirpinamos virinant, 20 ml terpės paskirstoma 25 x 150 mm tūbelėse be kraštų ir, geriausia, su medvilnės dangteliu.

Vamzdeliai su medvilniniu dangteliu. Šaltinis: autoriaus nuotr. Magistrantūra. Marielsa gil

Atsižvelgiant į prieinamumą, taip pat gali būti naudojami kiti vamzdžių dydžiai.

Jie autoklavuojami 10 minučių slėgio atmosferoje (121 ° C). Autoklavo laikas neturėtų būti viršytas. Išeinant iš autoklavo, mėgintuvėliai su laikikliu pasvirę, kol sukietėja fleitos snape.

Kitas būdas yra ištirpinti ingredientus kaitinant iki virimo. Autoklavas 10 minučių tame pačiame buteliuke, tada paskirstykite 20 ml į Petri lėkšteles.

Jei turite „Sabouraud“ dekstrozės agaro terpę, kurioje jau yra visi komponentai, pasverkite komercinės įmonės nurodytą kiekį už litrą vandens. Likę veiksmai yra tokie patys, kaip aprašyti aukščiau.

Sabouraud dekstrozės agaras (Emmons modifikacija)

Sverti:

- 20 gr dekstrozės

- 10 g peptono

- 17 gr agaro-agaro

- Išmatuokite 1000 ml distiliuoto vandens

Visi ingredientai sumaišomi, pH sureguliuojamas iki 6,9. Atlikite tą patį procesą, kaip ir ankstesnis atvejis.

Yra komercinių namų, kuriuose siūloma terpė su visais ingredientais. Tokiu atveju pasverkite ir paruoškite, kaip aprašyta ant įdėklo.

Sabouraudo dekstrozės agaras (Emmonso modifikacija) su chloramfenikoliu

Chloramfenikolio pradinis tirpalas

- Pasverkite 500 mg chloramfenikolio bazės

- Išmatuokite 100 ml 95% etanolio

- Sumaišykite

Sabouraud dekstrozės agaro terpė (Emmons) ruošiama taip, kaip aprašyta anksčiau, ir prieš autoklavą į kiekvieną terpės litrą įpilama 10 ml chloramfenikolio pradinio tirpalo.

Sabouraud Emmons dekstrozės agaras su cikloheksimidu

Cikloheksimido atsargų sprendimas

- Pasverkite 5 gr cikloheksimido

- Išmatuokite 100 ml acetono

- Sumaišykite

Sabouraud dekstrozės agaro terpė (Emmons) ruošiama taip, kaip aprašyta, ir prieš kiekvieną autoklavą į kiekvieną terpės litrą įpilama 10 ml pradinio cikloheksimido tirpalo.

Sabouraudo dekstrozės agaras (Emmons) su chloramfenikoliu ir cikloheksimidu

Sabouraud dekstrozės agaro terpė (Emmons) ruošiama taip, kaip aprašyta, ir prieš kiekvieną autoklavą į kiekvieną terpės litrą įpilama 10 ml pradinio chloramfenikolio tirpalo ir 10 ml cikloheksimido pradinio tirpalo.

Kiti antibiotikai, kuriuos galima pridėti

20 000 - 60 000 vienetų penicilino viename terpės vienete.

30 mg streptomicino viename terpės.

Abi terpės turi būti įterptos po to, kai terpė autoklavuojama, šiek tiek atvėsinama (50–55 ° C).

0,04 g neomicino litre terpės.

0,04 g gentamicino viename terpės vienete.

Ypatingos aplinkybės

Saugumo tikslais, norint išvengti sporų išsisklaidymo ir įkvėpimo, geriau sėti Sabouraud dekstrozės agarą pleišto formos mėgintuvėliuose (pasvirusiame fleitos snape), o ne Petri lėkštelėse.

Svarbu, kad „Sabouraud“ agaro mėgintuvėliai būtų uždengti medvilne, o ne užsukamu dangteliu, nes įrodyta, kad pusiau anaerobinės sąlygos slopina sporų susidarymą kai kuriose padermėse, pavyzdžiui, Coccidioides immitis. Taip pat dauguma grybelių yra aerobiniai.

Jei naudojate užsukamą dangtelį, neuždarykite hermetiškai.

QA

Paruoštai laikmenai turi būti taikoma kokybės kontrolė, kad būtų galima įsitikinti, ar ji tinkamai veikia. Tam sėjamos tam tikros kontrolinės atmainos.

Sabouraud dekstrozės agarui su chloramfenikoliu galima naudoti Candida albicans ATCC padermes, kurios turi puikiai augti. Kita plokštelė yra pasėjama Escherichia coli padermėmis, kurios turi būti visiškai slopinamos.

Taip pat inkubuojama neinokuliuota plokštelė, kurioje neturėtų augti jokie mikroorganizmai.

Sabouraud dekstrozės agarui su chloramfenikoliu ir cikloheksimidu galima naudoti Trichophyton mentagrophytes padermes, kurios turėtų gerai vystytis. Kita plokštelė yra pasėjama Aspergillus flavus paderme, kurioje neturi būti mažai augimo arba jo neturi būti. Be to, inkubuojama neinokuliuota plokštelė, kad būtų įrodytas jos sterilumas.

Sabouraud dekstrozės agarui su cikloheksimidu naudojamos Candida albicans, Trichophyton rubrum arba Microsporum canis padermės, kurios turi gerai augti.

Taip pat įtraukiama Aspergillus flavus padermė, kurios augimas yra nedidelis arba jos visai nėra. Galiausiai inkubuokite neinokuliuotą plokštelę, kad būtų galima kontroliuoti sterilumą.

Programos

Pradinė kultūra

Klasikiniame „Sabouraud“ dekstrozės agare yra 4 gramai dekstrozės ir jis yra puikus kaip pirminės izoliacijos terpė, nes parodo būdingą kiekvieno grybelio morfologiją.

Tai taip pat puikiai tinka parodyti pigmento gamybą. Tačiau tai nėra geriausia sporuliacijos stebėjimo priemonė.

Taip pat nerekomenduojama auginti Blastomyces dermatitidis, kurį slopina didelė esanti gliukozės koncentracija.

Kita vertus, auginant reikia atsižvelgti į tam tikras aplinkybes.

Kai kurie grybai geriausiai auga kambario temperatūroje, pavyzdžiui, pelėsiai, kiti sėkmingai auga esant 37 ° C, pavyzdžiui, kai kurios mielės, kiti gali augti esant abiem temperatūroms (dimorfiniai grybeliai).

Dėl šios priežasties tam pačiam mėginiui kartais reikia naudoti keletą „Sabouraud“ agaro plokštelių, nes dažnai viena plokštelė inkubuojama kambario temperatūroje, o kita - 37 ° C.

Pavyzdžiui, Sporothrix schenckii sėjamos į dvi plokšteles; vienas inkubuojamas kambario temperatūroje, kad gautų pelėsio fazę, o kitas inkubuojamas 37 ° C temperatūroje, norint gauti mielių fazę, tačiau pastarojoje į terpę būtina įpilti 5% kraujo.

Kitais atvejais, tokiais kaip mycetoma mėginiai, pasėjamos dvi Sabouraud agaro lėkštelės, viena su chloramfenikoliu, kita - cikloheksimidu. Pirmasis leis išauginti grybelinės kilmės mikotomos sukėlėjus (Eumycetoma), o antrasis - bakterinės kilmės mycetomos sukėlėjus, tokius kaip aktinomycetomos.

Sporuliacija

„Emmons Modified Sabouraud“ dekstrozės agare yra 2 gramai dekstrozės ir jis yra naudojamas ne tik izoliacijai, bet ir grybelių sporuliacijai bei konservavimui.

Šioje terpėje galima atkurti Blastomyces dermatitidis padermes.

Išsaugojimas

Norėdami išsaugoti grybų kultūras, juos galima laikyti šaldytuve (2–8 ° C). Konservavimo laikas gali skirtis nuo 2 iki 8 savaičių. Po šio laiko jie turi būti subkultūringi, kad pakartotų procesą.

Kai kurie grybai geriausiai laikosi kambario temperatūroje, pavyzdžiui, Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum ir Microsporum audounii.

Padermės išlaikymą galima pratęsti, kad būtų išvengta pleomorfizmo, jei dekstrozė visiškai pašalinama iš agaro ir jei agaro kiekis terpėje sumažinamas, kad būtų išvengta sausumo.

Mikrokultūros

Norint nustatyti kai kuriuos gijinius grybus, būtina atlikti mikrokultūras, naudojant Sabouraud agarą ar kitas specialias priemones, kad būtų galima stebėti seksualinio ir aseksualinio dauginimosi struktūras.

Žmogaus mikologijoje

Jis daugiausia naudojamas grybelinėms ligoms diagnozuoti, ypač toms, kurios veikia odą ir jos priedus (plaukus ir nagus).

Mėginiai gali būti sekretas, eksudatas, oda, plaukai, nagai, skrepliai, CSF ar šlapimas. Dažniausiai išskirti patogenai yra dermatofitai, grybeliai, sukeliantys poodinę ir sisteminę mikozes.

Gyvūnų mikologija

Gyvūnus dažnai paveikia grybelinės infekcijos, todėl Sabouraud agaras yra toks pat naudingas gyvūnų mikologijoje, kaip ir žmogus.

Pavyzdžiui, dermatofitai dažnai gali paveikti gyvūnus. Taip yra Microsporum canis var activum atveju, kuris dažnai užkrečia šunis, kates, arklius, kiaules ir beždžiones. Taip pat „Microsporum gypseum“ užkrečia šunis, kates ir gyvulius.

Paukščiai, tokie kaip vištos, gaidžiai ir vištos, yra paveikti Microsporum gallinae.

Kiti grybeliai, tokie kaip Zymonema farciminosum, taip pat yra gyvūnų, daugiausia arklių, mulų ir asilų, ligų priežastis, sukeliantys reikšmingą limfinių kraujagyslių uždegimą.

Sporothrix schenkii ir Histoplasma capsulatum veikia naminius gyvūnus ir žmones.

Aplinkos mikologija

Daugybė patogeninių ar oportunistinių grybelių gali susikaupti tam tikru metu tam tikroje aplinkoje, ypač klinikų ir ligoninių operacinėse ir intensyvios terapijos skyriuose. Todėl būtina juos kontroliuoti.

Kitos pažeidžiamos erdvės yra bibliotekos ir seni pastatai, kuriuos gali paveikti aplinkos grybelių koncentracija.

Aplinkosaugos tyrimuose grybams išskirti naudojamas Sabouraud dekstrozės agaras.

Pramoninė mikologija

Sabouraudo dekstrozės agaro negali trūkti tyrinėjant užterštus grybus gaminant kosmetiką, maistą, gėrimus, odą, tekstilę.

Augalų mikologija

Augalai taip pat kenčia nuo grybų sukeltų ligų, paveikiančių skirtingas augalų dalis, kurios netgi gali baigti derlių, sukeldamos didelius nuostolius žemės ūkyje.

Nuorodos

1. Cuenca M, „Gadea I“, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Mikozių mikozių diagnozė ir priešgrybeliniai jautrumo tyrimai. Ispanijos užkrečiamųjų ligų ir klinikinės mikrobiologijos draugijos rekomendacijos. Galima rasti: coesant-seimc.org
2. „ValteK“ laboratorija. (2009). Sabouraudo dekstrozės agaras su cikloheksimidu. Galima rasti: andinamedica.com.
3. Navarro O. (2013). Veterinarinė mikologija. Nacionalinis agrarinis universitetas. Nikaragva.
4. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. 2009. „Bailey & Scott“ mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Argentina. „Panamericana SA“ redakcija
5. Casas-Rincón G. Bendroji mikologija. 1994 m. 2-asis Venesuelos centrinio universiteto leidimas. Venesuelos Karakasas.