TSI AGARAS: PAGRINDIMAS, PARUOŠIMAS IR PANAUDOJIMAS - BIOLOGIJA - 2025

TSS agaro arba trigubas cukraus geležies agaro yra kieta terpė, kuri tarnauja kaip tam biocheminių bandymo nukreipti pradinio atpažinimo Gram neigiamas bakterijas. Tai pagrįsta esamų cukrų fermentacijos, vandenilio sulfido ir dujų susidarymo parodymu.

Jo sudėtis ir pagrindas yra labai panašūs į Kliglerio geležies testą, tuo skirtumu, kad pastarajame yra tik gliukozė ir laktozė. Kaip rodo jo pavadinimas, trigubo cukraus geležies agare yra trys fermentuojami angliavandeniai: gliukozė, laktozė ir sacharozė.

TSS bandymo su skirtingais mikroorganizmais vaizdai A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Šaltinis: Witmadrid, iš „Wikimedia Commons“

Be to, TSS terpė turi keturis baltymų darinius, kurie daro jį labai maistingu agaru: mielių ekstraktas, mėsos ekstraktas, peptonas ir proteozinis peptonas. Jame taip pat yra geležies amonio sulfato, natrio tiosulfato, natrio chlorido, fenolio raudonojo ir agaro.

Mikroorganizmo nesugebėjimas fermentuoti terpėje esančios gliukozės iš karto pašalina jį iš Enterobacteriaceae šeimos. Taigi šis bandymas yra būtinas nusprendžiant, kokį identifikavimo kelią reikia pasirinkti norint nustatyti gentį ir rūšis.

Kiekviena laboratorija nusprendžia, ar dirbti su TSI agaru, ar su Kliglerio geležies agaru.

Pagrindas

Kiekvienas iš junginių atlieka funkciją terpėje.

Natrio chloridas ir agaras

Natrio chloridas yra būtinas palaikyti terpės osmosinę pusiausvyrą. Kol agaras suteikia vientisą konsistenciją.

PH indikatorius (fenolio raudonas)

Paruoštos terpės pH subalansuojamas ties 7,3, o pH indikatorius (fenolio raudonas) tampa geltonas, žemiau 6,8. Tai reiškia, kad nedidelis rūgščių kiekis, gaunamas fermentuojant cukrų, pavers terpę iš raudonai oranžinės iki geltonos.

Jei fermentacija nevyksta, terpė bus šarminama naudojant peptonus, nuo raudonai oranžinės iki stiprios raudonos.

Baltymų dariniai (mielių ekstraktas, mėsos ekstraktas, peptonas ir proteino peptonas)

Kai bakterijos metabolizuoja baltymus, esančius TSI agare, susidaro aminai, šarminantys terpę (daugiausia kūginiu lygiu), nes reakcijai reikia deguonies. Aminai paryškina rėmelį ryškiai raudonai.

Bet tai priklausys nuo bakterijų sugebėjimo fermentuoti angliavandenius ar ne.

Angliavandenių (gliukozės, laktozės ir sacharozės) fermentacija

Cukrų fermentacijos tyrimas gali duoti keletą vaizdų ir kiekvienas jų aiškinamas skirtingai. Tyrimo aiškinimu mikroorganizmai suskirstomi į 3 kategorijas: gliukozės nefermentatoriai, laktozės nefermentatoriai ir laktozės / sacharozės fermentatoriai.

Reikėtų pažymėti, kad gliukozės kiekis terpėje yra ribotas, o laktozės ir sacharozės koncentracija yra 10 kartų didesnė.

Enterobakterijų šeimos bakterijos ir kiti gliukozę fermentuojantys mikroorganizmai pradės fermentuoti šį cukrų, nes tai yra paprasčiausias angliavandenis energijai gauti.

Kita vertus, laktozė ir sacharozė yra sudėtiniai angliavandeniai, kurie turi būti suskaidomi ir paverčiami gliukoze, kad jie galėtų patekti į Embdeno-Meyerhofo ciklą.

-Mikroorganizmai, nefermentuojantys gliukozės

Kai pasėtas mikroorganizmas negali fermentuoti gliukozės, daug mažiau jis galės fermentuoti kitus angliavandenius. Todėl čia nesusidaro jokios rūgštys, o naudojant peptonus, susidaro aminai.

Tokiu atveju rėmelis tampa stipriau raudonas, o vamzdelio dugnas gali likti nepakitęs arba jis taip pat gali būti šarminamas, paliekant visą mėgintuvėlį raudoną.

Aiškinimas: K / K reiškia šarminę kūginę / šarminę arba neutralią dugną

Paveikslėlyje, esančiame straipsnio pradžioje, žiūrėkite D vamzdžio atvaizdą.

Šis rezultatas rodo, kad mikroorganizmas nepriklauso enterobakterijų šeimai.

-Mikroorganizmai, nefermentuojantys laktozės / sacharozės

Jei bakterijos geba fermentuoti gliukozę, bet ne laktozę ar sacharozę, atsitiks taip:

Bakterijos sunaudos visą esančią gliukozę maždaug po 6–8 valandų ir galės parūgštinti tiek kūgį, tiek bloką; tai yra, agaras bus visiškai pageltęs. Kai gliukozė išeikvojama ir negalima naudoti laktozės bei sacharozės, bakterijos pradės baltymų metabolizmą.

Šiai reakcijai reikia deguonies, todėl peptonai skaidosi paviršiuje (kūginis). Gauti aminai šarmina dangtelį nuo geltonos iki raudonos. Ši reakcija pasireiškia po 18–24 valandų inkubacijos.

Aiškinimas: K / A reiškia šarminę kūginę ir rūgšties vatą.

Paveikslėlyje, esančiame straipsnio pradžioje, žiūrėkite vamzdelio B atvaizdą.

-Laktozę / sacharozę fermentuojantys mikroorganizmai

Mikroorganizmai, galintys fermentuoti laktozę ir sacharozę, akivaizdžiai gali fermentuoti gliukozę. Išnaudojus minimalų terpėje esančio gliukozės kiekį, susidaręs piruvatas pradeda metabolizuotis ir susidaro rūgštys per aerobinį Krebso ciklą, o per 8–12 valandų visa terpė bus geltona.

Jei bakterijos sugeba suskaidyti laktozę arba sacharozę, rūgštys bus gaminamos ir toliau, o po 18–24 valandų visas mėgintuvėlis - kūgis ir kamštis - toliau gels.

Reikėtų pažymėti, kad gliukozė naudojama dviem būdais: vienas aerobiškai prie vamzdžio kampo, o kitas anaerobiškai vamzdžio apačioje.

Aiškinimas: A / A reiškia rūgščią kūginę / rūgščią dugną. Tai gali turėti arba neturėti dujų.

Paveikslėlyje, esančiame straipsnio pradžioje, žiūrėkite A vamzdžio atvaizdą.

Dujų gamyba

Kai kurie mikroorganizmai gali gaminti dujas fermentuojant cukrų. Dujas vamzdyje parodo slėgis, kurį jos daro agare. Slėgis sukelia burbuliukų susidarymą arba agaro poslinkį. Kartais susidariusios dujos gali suskaidyti terpę.

Svarbu, kad sėjant TSS terpę, punkcija būtų atlikta švariai per agaro centrą, kol ji pasieks dugną. Jei punkcija bus nukreipta į vamzdelio sienas, gaminant dujas tai gali sukelti klaidingą teigiamą rezultatą, nes jis išeis per neteisingai suformuotą kanalą.

Gaminant dujas ir reaguojant į agaro kūgį, reikia deguonies, todėl vamzdelį rekomenduojama uždengti medvilnės kamščiu, o jei naudojamas bakelito dangtelis, jis neturėtų būti visiškai sandarus.

Dujų gamyba nurodoma kaip teigiama (+) arba neigiama (-).

Dujų susidarymo modeliai. Šaltinis: magistrantūros sudaryta schema. Marielsa Gil. Vaizdo šaltinis: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, naudojant „Wikimedia Commons“

Natrio tiosulfatas ir juodojo amonio sulfatas

Bakterijos, galinčios gaminti vandenilio sulfidą (bespalvės dujos), įsisavina sierą iš terpėje esančio natrio tiosulfato. Vieną kartą H ₂ S yra suformuotas, jis reaguoja su geležies amonio sulfato, gaminti geležies sulfido (aiškiai matoma juoda nuosėdoms).

Pranešama, kad H ₂ S produkcija yra teigiama (+) arba neigiama (-).

Paveikslėlyje, esančiame straipsnio pradžioje, žiūrėkite vamzdelio C atvaizdą.

Paruošimas

Pasverkite 62,5 g dehidratuoto trigubo cukraus geležies agaro (TSI) terpės ir ištirpinkite viename litre distiliuoto vandens.

Kaitinkite, kol agaras visiškai ištirps. Virkite minutę, dažnai maišydami. Paskirstykite 4 ml terpės į 13/100 mėgintuvėlius su medvilnės dangteliais.

Sterilizuokite autoklave 121 ° C temperatūroje 15 minučių. Išimkite iš autoklavo ir leiskite jam pailsėti kampu. Reikia žiūrėti, kad tiek pagrindas, tiek rėmas būtų vienodo atstumo.

Laikyti šaldytuve 2–8 ° C temperatūroje. Prieš sėjant bakterijų kamieną, leiskite jam sušilti.

Dehidratuota terpė yra šviesiai smėlio spalvos, o paruošta terpė yra raudonai oranžinė.

Galutinis paruoštos terpės pH yra 7,3 ± 0,2.

Programos

TSS testas plačiai naudojamas mikrobiologijos laboratorijoje. Šis bandymas yra labai svarbus nustatant bandymo, kuris turi būti atliekamas siekiant nustatyti gentį ir rūšį, tipą. Geras jo vykdymas ir aiškinimas gali sutaupyti medžiagų ir darbo.

Jei rezultatas yra TSS K / K, o citochromo oksidazės testas yra teigiamas, žinoma, kad testai turėtų būti naudojami nefermentuojant gramneigiamus strypus, tokius kaip Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia, tarp kitų genčių. Jei jis yra oksidazės neigiamas, jis orientuotas į Acinetobacter, Stenotrophomonas genus ir kt.

Kita vertus, jei bus gauta TSS A / A arba K / A ir citochromo oksidazės testas bus neigiamas, tuo daugiau nitratų sumažės iki nitritų, būsime tikri, kad tai yra mikroorganizmas, priklausantis Enterobacteriaceae šeimai. Tokiu atveju identifikavimo būdas bus sutelktas į specifinius šios bakterijų grupės tyrimus.

Kita vertus, jei gaunamas K / A arba A / A vaizdas ir citochromo oksidazės testas yra teigiamas, papildomi surinkti bandymai bus skirti nustatyti fermentacijos padermes, nepriklausančias Enterobacteriaceae šeimai, tokias kaip: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio ir Pasteurella.

TSS, kurioje yra neigiamos oksidazės vandenilio sulfido, padės nustatyti šias enterobakterijų šeimos gentis: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella arba Salmonella.

TSS, turinčio mažai arba vidutiniškai vandenilio sulfido šarminėje kūginėje dalyje, turinti šarminį foną ir teigiamą oksidazę, padės atlikti bandymai, skirti nustatyti nefermentuojančius H ₂ S gaminančius gramneigiamus strypus, tokius kaip Shewanella putrefaciens.

Galiausiai, TSS gali būti naudojama vandenilio sulfido susidarymui gramteigiamose bacilose, ypač įtarus Erysipelothrix rhusiopathiae.

Sėjama

TSS terpė turi būti pasėjama grynomis kolonijomis, išskirtomis pirminėse arba selektyvinėse kultūrose. Jei kolonija imama iš selektyvių terpių, į kurias buvo sėjami mėginiai su mišria flora, reikėtų atsargiai imti tik iš paviršiaus, nes toje terpėje slopinami gyvybingi štamai gali būti apatinėje kolonijos dalyje.

Todėl kilpa niekada neturėtų būti aušinama ant selektyviosios terpės, tada kolonija imama ir pasėjama TSS terpe.

Sėjama tiesia kilpa arba adata. Bus padaryta punkcija, pasirūpinant, kad ji būtų per vidurio vidurį, kol ji pasiekia dugną, o tada sėja baigiama sėjant paviršių zigzago pavidalu. Nedarykite dviejų punkcijų.

Inkubuokite aerobiozėje 37 ° C temperatūroje 18–24 valandas. Interpretuokite šiuo metu nei prieš, nei po to.

Apribojimai

TSS bandymas turėtų būti perskaitytas per 18–24 valandas nuo inkubacijos. Prieš tai perskaičiavus, A / A fermentacija gali būti klaidingai teigiama. Kadangi po šio laiko rodmenys gali sukelti klaidingą neigiamą nefermentatoriaus įvaizdį, nes sunaudojama peptonų, šarminančių terpę.

Nuorodos

1. Macas Faddinas J. (2003). Biocheminiai tyrimai klinikinės svarbos bakterijoms nustatyti. 3-asis leidimas Redakcija Panamericana. Buenos Airės. Argentina.
2. „Forbes B“, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey ir Scotto mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Redakcija Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5-asis leidimas Redakcija Panamericana SA Argentina.
4. "TSS agaras". Vikipedija, nemokama enciklopedija. 2018 m. Liepos 10 d., 08:09 UTC. 2019 m. Vasario 10 d., 03:33 Galima rasti: es.wikipedia.org
5. „Britannia“ laboratorijos. TSS agaras (trigubas cukraus geležies agaras). 2015.Atsiejama: britanialab.com
6. BD laboratorijos. Trigubas cukraus geležies agaras (agaro TSS). 2003. Prieinamas adresu: bd.com