RESTRIKCIJOS FERMENTAI: FUNKCIJOS, TIPAI IR PAVYZDŽIAI - BIOLOGIJA - 2025

Į restrikcijos fermentai yra endonukleazės tam tikra Archaea ir bakterijų dirbantys slopinti arba "apriboti" virusų plitimo viduje. Jie ypač paplitę bakterijose ir yra dalis jų gynybos sistemos nuo svetimų DNR, vadinamų restrikcijos / modifikavimo sistema.

Šie fermentai katalizuoja dvigubų juostų DNR skaidymą konkrečiose vietose, atkuriamai ir nenaudojant papildomos energijos. Daugumai jų reikia kofaktorių, tokių kaip magnis arba kiti dvivalentiai katijonai, nors kai kuriems taip pat reikia ATP arba S-adenozilmetionino.

HindIII restrikcijos fermento reakcijos schema (Šaltinis: „Helixitta“ per „Wikimedia Commons“)

Restrikcijos endonukleazes 1978 m. Atrado Danielis Nathansas, Arberis Werneris ir Hamiltonas Smithas, kurie už atradimą gavo Nobelio medicinos premiją. Jų vardas paprastai kilęs iš organizmo, kur jie pirmą kartą pastebėti.

Tokie fermentai yra plačiai naudojami kuriant DNR klonavimo metodus ir kitas molekulinės biologijos bei genų inžinerijos strategijas. Jų specifinės sekų atpažinimo savybės ir galimybė išpjauti sekas arti atpažinimo vietų daro juos galingais genetinio eksperimento įrankiais.

Fragmentai, kuriuos sukuria restrikcijos fermentai, veikę tam tikrą DNR molekulę, gali būti panaudoti pradinės molekulės „žemėlapiui“ atkurti, naudojant informaciją apie tas vietas, kur fermentas supjaustė DNR.

Kai kurie restrikcijos fermentai gali turėti tą pačią atpažinimo vietą DNR, tačiau jie nebūtinai ją pjauna vienodai. Taigi, yra fermentų, kurie pjauna paliekančius neryškius galus, ir fermentų, kurie nupjauna paliekančius vientisus galus, kurie skirtingai pritaikomi molekulinėje biologijoje.

Šiuo metu yra šimtai skirtingų komerciškai prieinamų restrikcijos fermentų, kuriuos siūlo skirtingi komerciniai namai; Šie fermentai veikia kaip „pritaikytos“ molekulinės žirklės įvairiems tikslams.

funkcijos

Restrikcijos fermentai vykdo priešingą polimerazių funkciją, nes jie hidrolizuoja arba sulaužo esterinį ryšį fosfodiesterio jungtyje tarp gretimų nukleotidų nukleotidų grandinėje.

Molekulinėje biologijoje ir genų inžinerijoje jie yra plačiai naudojami ekspresijos ir klonavimo vektorių konstravimo, taip pat specifinių sekų identifikavimo įrankiai. Jie taip pat yra naudingi rekombinantinių genomų konstravimui ir turi didelį biotechnologinį potencialą.

Dėl naujausių genų terapijos pasiekimų, šiuo metu naudojami restrikcijos fermentai, skirti įnešti tam tikrus genus į vektorius, kurie yra transporto priemonės tokiems genams pernešti į gyvas ląsteles ir kurie greičiausiai turi galimybę įterpti į ląstelės genomą atlikti. nuolatiniai pokyčiai.

Veiksmo mechanizmas

Restrikcijos fermentai gali katalizuoti dvigubos juostos DNR skaidymą, nors kai kurie sugeba atpažinti vienos juostos DNR sekas ir net RNR. Pjovimas įvyksta atpažinus sekas.

Veikimo mechanizmas susideda iš fosfodiesterio jungties hidrolizės tarp fosfato grupės ir dezoksiribozės kiekvienos DNR grandinės skeleto. Daugelis fermentų sugeba pjaustyti toje pačioje vietoje, kur jie yra atpažįstami, o kiti pjauna nuo 5 iki 9 bazinių porų prieš ar po jo.

Paprastai šie fermentai pjauna fosfato grupės 5 'galą, sukurdami DNR fragmentus, turinčius 5' fosforilo galą ir 3 'galinę hidroksilo galą.

Kadangi baltymai neturi tiesioginio kontakto su atpažinimo vieta DNR, jie turi būti perkeliami vienas po kito, kol bus pasiekta specifinė vieta, galbūt naudojant „stumdomus“ mechanizmus DNR grandinėje.

Fermentinio skaidymo metu kiekvienos DNR grandinės fosfodiesterinis ryšys yra vienoje iš restrikcijos fermentų aktyvių vietų. Kai fermentas palieka atpažinimo ir skilimo vietą, jis tai daro per nespecifines laikinas asociacijas.

Tipai

Šiuo metu žinomi penki restrikcijos fermentų tipai. Čia yra trumpas kiekvieno iš jų aprašymas:

I tipo restrikcijos fermentai

Šie fermentai yra dideli pentameriniai baltymai, turintys tris subvienetus: vienas restrikcijai, vienas metilinimui ir kitas sekos atpažinimui DNR. Šios endonukleazės yra daugiafunkciniai baltymai, galintys katalizuoti restrikcijos ir modifikavimo reakcijas, jie turi ATPazės aktyvumą, taip pat DNR topoizomerazę.

Šios rūšies fermentai buvo pirmieji endonukleazių atradimai, jie pirmą kartą buvo išgryninti septintajame dešimtmetyje ir nuo to laiko buvo tiriami nuodugniai.

I tipo fermentai nėra plačiai naudojami kaip biotechnologinė priemonė, nes skilimo vieta nuo atpažinimo vietos gali būti kintama iki 1000 bazinių porų, todėl eksperimentinio atkuriamumo požiūriu jie yra nepatikimi.

II tipo restrikcijos fermentai

Tai yra fermentai, sudaryti iš homodimerų arba tetramerų, kurie pjauna DNR apibrėžtose vietose nuo 4 iki 8 bp ilgio. Šios skilimo vietos paprastai yra palindrominės, tai yra, jos atpažįsta sekas, kurios skaitomos vienodai abiem kryptimis.

Daugelis II tipo restrikcijos fermentų, esančių bakterijose, supjausto DNR, kai atpažįsta jos svetimą pobūdį, nes jis neturi tipinių modifikacijų, kurias turėtų pati savo DNR.

Tai yra paprasčiausi restrikcijos fermentai, nes DNR sekoms atpažinti ir supjaustyti jiems nereikia jokio kito kofaktoriaus, išskyrus magnį (Mg +).

Dėl II tipo restrikcijos fermentų tikslumo atpažįstant ir išpjaustant paprastas DNR sekas tiksliose vietose, jie tampa vienu iš plačiausiai naudojamų ir būtinu daugelyje molekulinės biologijos šakų.

II tipo restrikcijos fermentų grupėje yra keli poklasiai, klasifikuojami pagal tam tikras savybes, kurios yra būdingos kiekvienam iš jų. Šie fermentai klasifikuojami pridedant abėcėlės raides nuo A iki Z po fermento pavadinimo.

Kai kurie poklasiai, labiausiai žinomi dėl savo naudingumo, yra:

IIA poklasis

Jie yra skirtingų subvienetų dimeriai. Jie atpažįsta asimetrines sekas ir yra naudojami kaip idealūs pirmtakai pjaustymo fermentų generavimui.

IIB poklasis

Jie sudaryti iš vieno ar daugiau dimerų ir išpjauti DNR iš abiejų atpažinimo sekos pusių. Jie supjaustė abi DNR grandines bazinės poros intervalu prieš atpažinimo vietą.

IIC poklasis

Šio tipo fermentai yra polipeptidai, turintys DNR grandžių dalijimosi ir modifikavimo funkcijas. Šie fermentai abiem sruogomis pjauna asimetriškai.

IIE poklasis

Šio poklasio fermentai yra labiausiai naudojami genų inžinerijoje. Jie turi katalizinę vietą ir paprastai reikalauja alosterinio efektoriaus. Šie fermentai turi sąveikauti su dviem jų atpažinimo sekos kopijomis, kad būtų galima veiksmingai skaidyti. Šiame poklasyje yra fermentai EcoRII ir EcoRI.

III tipo restrikcijos fermentai

III tipo restrikcijos endonukleazes sudaro tik du subvienetai, vienas yra atsakingas už DNR atpažinimą ir modifikavimą, o kitas yra atsakingas už sekos skaidymą.

Šiems fermentams veikti reikalingi du kofaktoriai: ATP ir magnis. Šio tipo restrikcijos fermentai turi dvi asimetrines atpažinimo vietas, perkelia DNR priklausomai nuo ATP ir supjausto ją tarp 20–30 bp greta atpažinimo vietos.

IV tipo restrikcijos fermentai

IV tipo fermentus nesunku atpažinti, nes jie DNR supjaustomi metilinimo žymėmis. Jie yra sudaryti iš kelių skirtingų subvienetų, atsakingų už DNR sekos atpažinimą ir pjaustymą. Šie fermentai kaip kofaktorius naudoja GTP ir dvivalentį magnį.

Specifinės skilimo vietos apima nukleotidų gijas su metilintais arba hidroksimetilintais citozino likučiais vienoje ar abiejose nukleorūgščių sruogose.

V tipo restrikcijos fermentai

Ši klasifikacija sugrupuoja CRISPER-Cas tipo fermentus, kurie identifikuoja ir išpjauna invazinių organizmų specifines DNR sekas. Cas fermentai naudoja CRISPER sintezuotos kreipiamosios RNR grandinę, kad atpažintų ir užpultų įsiveržiančius organizmus.

Fermentai, klasifikuojami kaip V tipas, yra polipeptidai, susisteminti pagal I, II ir II tipo fermentus. Jie gali iškirpti beveik bet kurio organizmo DNR sekcijas, kurių ilgis yra platus. Dėl šių lankstumo ir patogumo naudoti šiuos fermentus, kaip ir II tipo fermentus, yra viena iš plačiausiai naudojamų genų inžinerijos priemonių.

Pavyzdžiai

Restrikcijos fermentai buvo naudojami aptikti DNR polimorfizmus, ypač populiacijos genetiniuose tyrimuose ir evoliucijos tyrimuose, naudojant mitochondrijų DNR, siekiant gauti informacijos apie nukleotidų pakaitų greitį.

Šiuo metu vektoriai, naudojami įvairiems tikslams bakterijų transformacijai, turi multiklonavimo vietas, kuriose yra daugybės restrikcijos fermentų atpažinimo vietos.

Tarp šių fermentų populiariausi yra EcoRI, II, III, IV ir V, gauti ir aprašyti pirmą kartą iš E. coli; HindIII iš H. influenzae ir BamHI iš B. amyloliquefaciens.

Nuorodos

1. Bickle, TA ir Kruger, DH (1993). DNR ribojimo biologija. Mikrobiologiniai atsiliepimai, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA, ir Horvath, P. (2007). CRISPR suteikia įgytą atsparumą virusams prokariotuose. Mokslas, 315 (kovas), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Molekulinė perspektyva: Restrikcijos endonukleazės. Kamieninių ląstelių vėžio medicinos pagrindai, 20, 190–191.
4. Halfordas, SE (2001). Šuolis, šokinėjimas ir kilpinimas restrikcijos fermentais. Biocheminės bendrijos transakcijos, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Rūšių tapatybės palaikymas ir bakterijų specifikacijos kontrolė: ar naujoji apribojimo / modifikavimo sistemų funkcija? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewino genai XII (12 red.). Burlingtonas, Masačusetsas: Jones ir Bartlett mokymasis.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… Ji, Q. (2015). I ir III tipo CRISPR-Cas sistemų panaudojimas genomo redagavimui. Branduolinių rūgščių tyrimai, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA ir Wilson, GG (2013). I tipo restrikcijos fermentai ir jų artimieji. Branduolinių rūgščių tyrimai, 1–25.
9. Nathans, D., & Smith, HO (1975). Restrikcijos endonukleazės analizuojant ir pertvarkant DNR molekules. Annu. Biochem. , 273–293.
10. Nei, M., ir Tajima, F. (1981). Dna polimorfizmas, aptinkamas restrikcijos endonukleazėmis. Genetika, 145–163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Ląstelių ir molekulinių gyvybės mokslų II tipo restrikcijos endonukleazės: struktūra ir mechanizmas. CMLS Ląsteliniai ir molekuliniai gyvybės mokslai, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Kaip restrikcijos fermentai tapo molekulinės biologijos žirgais. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, R. J., ir Murray, K. (1976). Restrikcijos endonukleazės. Kritinės apžvalgos biochemijoje, (lapkritis), 123–164.
14. Stoddard, BL (2005). Homingo endonukleazės struktūra ir funkcija. Ketvirtiniai biofizikos apžvalgos, 1–47.
15. „Tock“, MR ir „Dryden“, DTF (2005). Restrikcijos ir anti-restrikcijos biologija. Dabartinė nuomonė mikrobiologijoje, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Wilsonas, G. G. ir Murray, NE (1991). Apribojimo ir modifikavimo sistemos. Annu. Genetas. , 25, 585-627.
17. Wu, Z., ir Mou, K. (2016). Genominės įžvalgos apie Campylobacter jejuni virulentiškumą ir populiacijos genetiką. Infekcija. Dis. Transl. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Daugiafunkcinių restrikcijos endonukleazių struktūra ir mechanizmas. Annu. Biochem. , 50, 285-315.