FERMENTO AKTYVUMAS: VIENETAS, MATAVIMAS, REGULIAVIMAS IR VEIKSNIAI - CHEMIJA - 2025

Fermentinis aktyvumas yra būdas išreikšti esančio fermento kiekį tam tikru laiku. Parodo substrato, paversto į produktą, kiekį kataliziškai veikiant fermentui per laiko vienetą.

Tam įtaką daro sąlygos, kuriomis vyksta fermentinė reakcija, todėl paprastai nurodoma temperatūra, kurioje ji matuojama. Bet kas yra fermentai? Tai yra biologiniai katalizatoriai, galintys pagreitinti reakcijos greitį, nepatirdami negrįžtamų pokyčių katalizuoto proceso metu.

Ananasai arba ananasai, vaisiai, kuriuose yra bromelaino fermento, todėl pasižymi dideliu fermentiniu aktyvumu Šaltinis: H. Zell

Fermentai, paprastai, yra baltymai, išskyrus ribosomas, RNR molekules, turinčias fermentinį aktyvumą.

Fermentai padidina reakcijos greitį sumažindami energijos barjerą (aktyvacijos energiją); kuris turi būti pasibaigęs, kad pasiektų pereinamąją būseną ir tokiu būdu įvyktų reakcija.

Substrato molekulės, pasiekiančios pereinamąją būseną, patiria struktūrinius pokyčius, dėl kurių atsiranda produkto molekulės. Atsižvelgiant į jų atliekamas funkcijas, fermentai skirstomi į šešias dideles grupes: oksireduktazes, transferazes, hidrolazes, lizazes, izomerazes ir ligasus.

Pavyzdžiui, fermentai bromelainas ir papainas yra proteolitiniai fermentai (hidrolazės), randami atitinkamai ananasuose ar ananasuose, ir papajoje ar papajoje.

Yra žinoma, kad tiek ananasai, tiek papajos palengvina virškinimo procesą, nes veikdami juose esančius proteolitinius fermentus jie padeda virškinti baltymus iš mėsos ir grūdų.

Fermento aktyvumo vienetas

Fermento vienetas (TV) yra fermento kiekis, katalizuojantis 1 µmol substrato virsmą per vieną minutę.

Vėliau Tarptautinė vienetų sistema (SI) apibrėžė fermento aktyvumo vienetą kaip fermento kiekį, kuris per sekundę paverčia 1 molį substrato produktu. Šis vienetas gavo katal (kat) pavadinimą.

1 mol = 10 ⁶ μmol ir 1 minutė = 60 sekundžių.

Todėl 1 katalonas yra lygus 60 · 10 ⁶ TV. Kadangi katal yra didelis vienetas, dažnai naudojami mažesni vienetai, tokie kaip: mikrokatal (μkat), ^10–6 katal ir nanokatal (πkat), ^10–9 katal.

Specifinė veikla

Tai fermento aktyvumo vienetų skaičius, padalytas iš baltymo miligramų bandinyje. Specifinis aktyvumas yra tiesiogiai susijęs su fermento gryninimo laipsniu.

Kaip matuojamas fermento aktyvumas?

Yra keli fermento aktyvumo nustatymo metodai. Tam tikro metodo pasirinkimas priklausys nuo fermento tyrimo tikslo; metodo pritaikomumas; galimybė naudotis įranga, reikalinga eksperimentui atlikti; tam tikro metodo naudojimo išlaidos ir kt.

Yra spektrofotometriniai, fluorometriniai, chemiliuminescenciniai, kalorimetriniai, radiometriniai ir chromatografiniai metodai.

Spektrofotometriniai metodai gali būti kolorimetriniai ir nuskaityti elektromagnetinės spinduliuotės ultravioletinėje (UV) srityje.

-Kolorimetrinis metodas

Jis pagrįstas chromoforo susidarymu fermentiniu būdu. Fermento aktyvumą galima sekti nuolat arba pertraukiamai.

Tęstinė forma

Nepertraukiamo pavidalo reagentai dedami į kiuvetę spektrofotometru norimo bangos ilgio, kuris atitinka tą, kuriame chromoforas turi didžiausią optinio tankio vertę; ir kad be to, nėra trukdžių kitai medžiagai, kuri gali būti sukurta.

Fermentinė reakcija pradedama pridedant mėginį, kuriame yra fermentas, kurio aktyvumas turi būti nustatytas. Tuo pačiu metu paleidžiamas chronometras ir laikas nuo laiko pažymima optinio tankio vertė.

Kadangi optinio tankio ekvivalentiškumas substrato moliams arba fermento veikimo produktui yra žinomas, atsižvelgiant į naudojamą metodą, galima apskaičiuoti sunaudoto substrato molius arba pagamintus molius.

Be to, kadangi buvo išmatuotas praėjęs fermentinės reakcijos laikas, galima gauti per sekundę sunaudotus ar pagamintus apgamus. Taigi fermentinis aktyvumas nustatomas katalų vienetais.

Pastovi forma

Partijos forma fermentiniam aktyvumui nustatyti mėgintuvėliai su reakcijos komponentais, išskyrus mėginį, kuriame yra fermentas ar kitas komponentas, dedami į vonią 37 ° C temperatūroje. Tada reakcija pradedama pridedant trūkstamą komponentą.

Leidžiamas laikas, kurį nurodo technika, ir reakcija nutraukiama pridedant junginio, kuris sustabdo reakciją. Tą akimirką nuskaitomas optinis tankis ir, pagaliau, nenutrūkstamai nustatomas fermentinis aktyvumas.

-Rodymo ultravioletinėje šviesoje metodika

Pavyzdžiui, kofermento nikotinamidadinukleotidas yra dviejų formų: NADH (redukuotas) ir NAD ⁺ (oksiduotas). Taip pat kofermento nikotinamiškumo nukleotidfosfatas turi dvi formas - NADPH ir NADP ⁺ , atitinkamai redukuotas ir oksiduotas.

Tiek redukuotos, tiek oksiduotos kofermento formos yra skaitomos 260 nm ilgio ultravioletinėje šviesoje; tuo tarpu 340 nm ilgio nuo ultravioletinės spinduliuotės gali būti skaitomos tik redukuotos formos.

Taigi tiek oksidacijos, tiek redukcijos reakcijose, kuriose dalyvauja minėti koenzimai, jie skaitomi ties 340 nm.

Fermentinio aktyvumo nustatymas iš esmės yra toks pats, kaip ir atliekant nuolatinę kolorimetrinio metodo formą; išskyrus tai, kad optinis tankis ties 340 nm yra skaitomas norint stebėti NADH ar NADPH generaciją arba išmatuoti šių koenzimų sunaudojimą.

Tai priklausys nuo to, ar išmatuota reakcija yra oksidacija, ar redukcija. Naudojant optinio tankio ir NADH bei NADPH molekulių atitiktį, fermentinis aktyvumas gali būti apskaičiuojamas dalijant kofermento masei iš praleisto laiko sekundėmis.

Fermentų aktyvumo reguliavimas

Kontrolė substrato ar gaminio lygiu

Didėjant substrato koncentracijai, fermento aktyvumas didėja. Bet esant tam tikrai substrato koncentracijai, aktyvioji arba aktyviosios fermento vietos yra prisotintos, taigi fermento aktyvumas tampa pastovus.

Tačiau fermentinio veikimo produktas taip pat gali sąveikauti su aktyviomis fermento vietomis, slopindamas fermentinį aktyvumą.

Produktas gali veikti kaip konkurencijos slopiklis; pavyzdžiui, gali būti paminėtas fermentas heksokinazė. Šis fermentas gamina gliukozės fosforilinimąsi, sudarydamas gliukozės-6-fosfatą - junginį, kuris kaupdamasis slopina heksokinazę.

Atsiliepimų kontrolė

Gali atsitikti taip, kad grupė fermentų (A, B, C, D, E ir F) paeiliui veikia metabolizmo būdu. Fermentas B naudoja substrato fermento A produktą ir pan.

Ląstelė, atsižvelgiant į jos metabolinius poreikius, gali suaktyvinti arba slopinti fermentų aktyvumą. Pavyzdžiui, fermento F produktas gali kauptis slopindamas fermentą A arba bet kurį kitą iš sekos fermentų.

Alosteriniai fermentai

Fermentą gali sudaryti keli subvienetai, kiekvienas su savo atitinkamomis aktyviomis vietomis. Bet šie subvienetai neveikia savarankiškai, todėl vieno iš subvienetų veikla gali suaktyvinti arba slopinti likusiųjų veiksmus.

Nors hemoglobinas nėra laikomas fermentu, jis yra puikus alosterizmo reiškinio modelis. Hemoglobiną sudaro keturios baltymų grandinės, dvi α ir dvi β grandinės, kiekviena iš jų prijungta prie hemo grupės.

Tarp subvienetų gali atsirasti du reiškiniai: homoalosterizmas ir heteroalosterizmas.

Homoalosterizmas

Substrato surišimas su vienu iš subvienetų padidina kitų subvienetų afinitetą substratui, savo ruožtu padidindamas kiekvieno likusio subvieneto fermentinį aktyvumą.

Panašiai fermentinio aktyvumo slopinimas viename iš subvienetų sukelia tą patį poveikį ir likusiuose.

Hemoglobino atveju deguonies prisijungimas prie vienos iš baltymų grandinių hemo grupės padidins likusių deguonies polinkį į deguonį.

Taip pat deguonies išsiskyrimas iš hemo grupės sukelia deguonies išsiskyrimą iš likusių baltymų grandinių grupių.

Heterolosterizmas

Aktyvinančios arba slopinančios medžiagos, išskyrus substratą, prisijungimas prie vieno iš subvienetų sukels fermento aktyvumo aktyvavimą ar slopinimą kituose subvienetuose.

Hemoglobino atveju jungimasis su H ⁺ , CO ₂ ir 2,3-difosfogliceriu hemo grupe prie vieno iš subvienetų sumažina hemo grupės afinitetą deguoniui, sukeldamas jo išsiskyrimą. Šis deguonies išsiskyrimas gaminamas ir kitose hemoglobino grandinėse.

Fermentų veiklą įtakojantys veiksniai

- Pagrindo koncentracija

Didėjant substrato koncentracijai, didėja ir fermento aktyvumas. Taip yra dėl padidėjusio substrato molekulių prieigos prie aktyviųjų fermento vietų.

Bet dėl ​​tam tikros substrato koncentracijos visos aktyvios fermento vietos yra prisotintos jo, todėl fermentinis aktyvumas nepadidėja, net padidėjus substrato koncentracijai.

-pH iš fermentinės reakcijos

Fermentų pH yra optimalus, kai fermento afinitetas substratui yra didžiausias. Esant šiam pH, pasiekiama didžiausia fermento aktyvumo vertė.

Dėl per didelės terpės rūgštingumo ar šarmingumo fermentas gali denatūruoti, todėl sumažėja jo aktyvumas.

Fermento aktyvumo pH profilis yra įvairus. Taigi, pavyzdžiui, pepsino didžiausias aktyvumas yra tarp 1-2 pH vienetų; tripsino optimalus pH yra 8; ir papaino pastovus aktyvumas yra tarp pH ir nuo 4 iki 8.

- Fermentinės reakcijos temperatūra

Fermento aktyvumas didėja didėjant temperatūrai. Paprastai fermento aktyvumas padvigubėja kas 10 padidėjimo laipsnių, kol pasiekiama optimali fermento aktyvumo temperatūra.

Tačiau kai viršijama optimali temperatūra, padidėjant reakcijos temperatūrai, fermento aktyvumas mažėja. Taip yra dėl to, kad baltymai, taigi ir fermentai, denatūruojami dėl per didelio temperatūros padidėjimo.

-Joninė reakcijos koncentracija

Paprastai fermentų optimalus aktyvumas yra 0–500 mmol / L. Tačiau esant didesnei koncentracijai, fermento aktyvumas mažėja.

Šiomis aplinkybėmis blokuojama tam tikra jonų fermentų sąveika, būtina jų maksimaliam aktyvumui.

Nuorodos

1. Segelis, IH (1975). Biocheminiai skaičiavimai. (2 ^-asis leidimas). John Wiley & Sons, INC
2. Lehninger, AL (1975). Biochemija. (2 ^-asis leidimas). Verta leidėjų, įskaitant
3. Mathews, CK, van Holde, KE ir Ahern, KG (2002). Biochemija. (3 ^ra leidimas). Pearsonas Addisonas Weshley'as.
4. Vikipedija. (2019 m.). Fermento tyrimas. Atkurta iš: en.wikipedia.org
5. González Juanas Manuelis. (sf). Kinetinis fermentas. Biomolekulių kursas. Atkurta iš: ehu.eus